类胡萝卜素含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 440/470/646/663 nm处的吸光度）
• 96孔板（非聚苯乙烯材质）或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、10 mL离心管/试管
• 分析天平、离心机
• 去离子水、丙酮
• 匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：自备 80%丙酮，将丙酮：去离子水（V:V）=4:1混合待用，提供一个 125 mL空瓶，4℃避光保存 1 周。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

样本制备

1. 新鲜植物叶片（去掉中脉）或其他组织用去离子水洗干净，然后吸干表面水分，称取约 0.1 g，剪碎放入研钵或匀浆器中。
2. 加入 1 mL去离子水，少量 Reagent I（约 10 mg），在黑暗或弱光条件下充分研磨，转入 10 mL离心管或试管中。
3. 用 Extraction Buffer冲洗研钵或匀浆器，将所有冲洗液转入 10 mL离心管或试管中，用 Extraction Buffer定容至 10 mL，置于黑暗条件或者包上锡箔纸浸提 3 h（期间可以颠倒混合 2次），观察底部组织残渣接近于白色则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至组织残渣颜色接近于白色。

实验步骤

A. 黄色或其他非绿色组织（不含叶绿体）类胡萝卜素含量测定步骤：

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 440 nm。可见光分光光度计用 Extraction Buffer调零。
2. 样本检测（微量玻璃比色皿检测不用测空白管，用 96孔板（非聚苯乙烯材质）检测空白管只需检测 1-2次）

用分光光度计检测：于微量玻璃比色皿快速测定 440 nm处测定孔吸光值，记为 A440。

用酶标仪检测：于 96孔板（非聚苯乙烯材质），快速测定 440 nm处吸光值，分别记为 A440 测定、A440 空白，ΔA440=A440 测定-A440 空白。

B. 新鲜植物叶片或其他绿色组织（含叶绿体）类胡萝卜素含量测定步骤：

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节多波长至 470 nm、646 nm和 663 nm。可见光分光光度计用 Extraction Buffer调零。
2. 样本检测（微量玻璃比色皿检测不用测空白管，用 96孔板（非聚苯乙烯材质）检测空白管只需检测 1-2次）

用分光光度计检测：于微量玻璃比色皿快速测定 470 nm、646 nm和 663 nm处测定孔吸光值，分别记为 A470、A646和 A663。 用酶标仪检测：于 96孔板（非聚苯乙烯材质），快速测定 470 nm、646 nm和 663 nm处吸光值，分别记为 A470 测定、A470 空白、A646 测定、A646 空白、A663 测定、A663 空白。计算ΔA470=A470 测定-A470 空白、ΔA646=A646 测定-A646 空白、ΔA663=A663 测定-A663 空白。

结果计算

A. 黄色或其他非绿色组织（不含叶绿体）类胡萝卜素含量的计算公式：

1. 使用 96孔板（非聚苯乙烯材质）测定的计算公式如下

V 样总：Extraction Buffer总体积，0.01 L；1,000：单位换算系数，1 g=1,000 mg；ε：类胡萝卜素经验消光系数，250 L/g/cm；d：96孔板（非聚苯乙烯材质）光径，0.5 cm；F：稀释倍数；W：样本质量，g。

2. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

B、新鲜植物叶片或其他绿色组织（含叶绿体）类胡萝卜素含量的计算公式：

1. 使用 96孔板（非聚苯乙烯材质）测定的计算公式如下

V 样总：Extraction Buffer总体积，0.01 L；F：稀释倍数；W：样本质量，g。

2. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

1. 若不确定组织中有无叶绿素影响，可取样本提取液采用分光光度计在波长 400-700 nm下进行扫描，看波长 640-670 nm之间有无波峰，有波峰则为有叶绿素，反之则无。
2. 若使用聚苯乙烯材质的 96孔板，请在加样后 5 min内尽快测定完成。
3. 为了避免色素见光分解，操作时应尽量避光，研磨或匀浆时应尽量缩短时间。
4. 提取液易挥发且有刺激性气味，操作时做好防护措施。