植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 485 nm处的吸光度）
• 96孔石英板/玻璃板（非聚苯乙烯/聚丙烯材质）或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、5 mL EP管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水、乙酸乙酯
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：临用前配制；每瓶加入 50 mL去离子水，充分溶解待用；4℃避光保存 1周。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent III：乙酸乙酯。（自备）

注意：Reagent I 和 Reagent III 有毒，建议在通风橱进行实验。

样本制备

植物组织：称取约 0.1 g新鲜样本（建议使用无色根系样本），用去离子水清洗 3-4次，用滤纸吸干水分，备用。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 485 nm，可见光分光光度计用乙酸乙酯调零。
2. 操作表（下述操作在 5 mL EP管中操作）：

充分混匀，37℃，暗培养 3 h，取出后立即冰浴 5 min，去滤液，尽量用滤纸吸干样本，置于匀浆器或研钵中。

充分研磨后，用 Reagent III 定容至 2 mL，12,000 g，4℃，离心 5 min，取 200 μL上清至 96孔石英板/玻璃板（非聚苯乙烯/聚丙烯材质）或微量玻璃比色皿中，测定 485 nm下的吸光值。测定孔记为 A 测定，对照孔记为 A 对照，计算ΔA=A 测定-A 对照。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果 A大于 1.5或ΔA大于 1，上清液可用 Reagent III 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少样本量。如果ΔA小于 0.1，可适当增大样本量，同步修改计算公式。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

PDHA活性的计算：

按样本鲜重计算：

单位的定义：在 37℃时，每小时每克组织样本使反应体系吸光值每增加 0.005为一个酶活单位。

PDHA(U /g 鲜重)=ΔA÷0.005÷T÷W=66.7×ΔA÷W

T：反应时间，3 h；W：样本质量，g。

注意事项

1. 配制好的 ReagentⅠ避光保存于 4℃，尽量在一周内使用，若出现红色，则不能使用。
2. 反应完成后立即冰浴以终止反应，并将残留的反应液尽量去除干净。
3. Reagent III 易挥发，有毒，与 Reagent III 有关的反应，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套，在通风橱中操作。
4. 建议用新鲜无色根系样本检测 PDHA。对于有色样本，可以在加 Reagent III 之前，先用去离子水进行研磨，12,000 g，4℃，离心 5 min弃掉上清，沉淀加 Reagent III 研磨，收集研磨液定容，按照实验步骤离心取上清检测。