植物叶绿素(Chlorophyll)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 645 nm和 663 nm处的吸光度）
• 96孔板（非聚苯乙烯材质）或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 分析天平
• 去离子水、无水乙醇、丙酮
• 研钵或匀浆器、10 mL玻璃试管、锡箔纸

试剂准备

Extraction Buffer：临用前配制；自备无水乙醇和丙酮，按体积比将无水乙醇：丙酮=1:2混合待用；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

样本制备

1. 取新鲜植物叶片或其它绿色组织，用去离子水洗干净，然后吸干表面水分，去掉中脉，称取约 0.1 g，剪碎放入研钵或匀浆器中。
2. 向研钵中加入 1 mL去离子水，然后加入 50 mg Reagent I（无需溶解），在黑暗或弱光条件下充分研磨，转入 10 mL玻璃试管中。
3. 用 Extraction Buffer冲洗研钵或匀浆器，将所有冲洗液与绿色物质转入 10 mL玻璃试管中，用 Extraction Buffer定容至 10 mL，置于黑暗条件下或者包上锡箔纸浸提 3 h，观察底部组织残渣颜色接近于白色则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至组织残渣颜色接近于白色。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 645 nm和 663 nm。可见分光光度计用 Extraction Buffer调零。
2. 取上层浸提液 200 μL于微量玻璃比色皿或 96孔板中（若使用聚苯乙烯材质的 96孔板，请在 5 min内尽快测定完成），测定 663 nm和 645 nm处吸光值，分别记为 A663和 A645。

结果计算

叶绿素 a含量 (mg/g 鲜重)=(12.7×A663–2.69×A645)×V 样总×F÷W÷1,000=0.01×(12.7×A663–2.69×A645)×F÷W

叶绿素 b含量 (mg/g 鲜重)=(22.9×A645–4.68×A663)×V 样总×F÷W÷1,000=0.01×(22.9×A645–4.68×A663)×F÷W

叶绿素总含量 (mg/g 鲜重)=(12.7×A663-2.69×A645)×V 样总×F÷W÷1,000+(22.9×A645-4.68×A663)×V 样总×F÷W÷1,000
=(20.21×A645+8.02×A663)×V 样总×F÷W÷1,000=0.01×(20.21×A645+8.02×A663)×F÷W

V 样总：提取液体积，10 mL；F：稀释倍数；W：样本质量，g。

注意事项

1. 叶绿素对光敏感，研磨和提取等操作尽量避光或者在弱光下进行。
2. 不同叶片硬度不同，尽量研磨充分。
3. 用提取液冲洗研钵一定要冲洗至所有的绿色物质被转移至玻璃试管。
4. 一定要浸提至组织残渣完全变白，否则提取不充分。