酸性磷酸酶(ACP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 510 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Standard：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

注意：Reagent III 有毒，Extraction Buffer和 Standard有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 动植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 rpm，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 血清（浆）：血浆和血清可以直接用于测定。血浆制备时不能用 EDTA和柠檬酸盐，可用其它抗凝剂。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 510 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。
2. Reagent I 置于 37℃水浴中预热 30 min以上。

操作表（下述操作在 96孔板中进行）：

混匀后置于 37℃中保温 15 min

混匀后于 510 nm处测定吸光度，其中标准和空白只需做一个，每个样本均需设置对照，各孔的吸光度分别记为 A 测定、A 对照、A 空白、A 标准。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA 测定小于 0.1，可适当增大样本量，如果样本的ΔA 测定大于 1.5，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，再进行实验，乘以最终的稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1 μmol酚为一个酶活力单位。

ACP (U/mg prot)=0.133×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr

ACP (U/mg prot)=(C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×V 样)÷(Cpr×V 样)÷T

2. 按样本鲜重计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化产生 1 μmol酚为一个酶活力单位。

ACP(U/g 鲜重)=0.133×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

ACP(U/g 鲜重)=(C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×V 样)÷(W÷V 提取×V 样)÷T

3. 按液体体积计算

活性单位定义：37℃中每毫升血清或血浆每分钟催化产生 1 μmol酚为一个酶活力单位。

ACP (U/mL)=0.133×ΔA 测定÷ΔA 标准

ACP (U/mL)=(C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准)÷T

C 标准：标准品的浓度，2 μmol/mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02 mL；T：反应时间，15 min；V 提取：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；W：样本鲜重，g；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项

1. ReagentⅠ、Reagent II 和 Reagent III 均需避光保存。
2. Reagent III 变蓝绿色后不能再使用。
3. 加入 Reagent III 后必须立即混匀，否则显色不完全。
4. ACP不稳定，尤其在 37℃和 pH大于 7的条件下活力丧失快，因此 ACP样本一般需当天准备；血清样本中，每毫升血清中加入 10 mg柠檬酸氢二钠或者 5 mg硫酸氢钠，使 pH 降至 6.5以下，或 5 mL血清加入 30%醋酸溶液 2～3滴，置于 4℃可保存 1周。