线粒体转氢酶-1(TH-1)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外光分光光度计（能测 375 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。

Working Reagent：临用前配制；将 Reagent IV、V 转移到 Reagent III 中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5 min；用不完的试剂分装后-20℃避光保存 1个月，禁止反复冻融。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

组织中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 称取约 0.1 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆；
2. 600 g，4℃离心 5 min。弃沉淀，将上清液移至另一离心管中；
3. 11,000 g，4℃离心 10 min，此步中上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1（可选做）；
4. 步骤 3中沉淀即为线粒体，加入 500 μL Reagent II，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30次），用于 TH-1活性测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 375 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

3. 混匀，立即记录 375 nm处初始吸光值 A1和 10 min后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.25可适当加大样本量。如果ΔA大于 1.2，样本可用 ReagentⅠ或 Reagent II 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

TH-1活性的计算：

1.按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每 g组织每分钟产生 1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=149×ΔA÷W

V 反总：反应总体积，2×10^-4 L；ε：APADPH摩尔消光系数，6.7×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 样：反应体系中加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Reagent II 体积，0.5 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10 min。