乙酰胆碱(Ach)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 540 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、制冰机、涡旋震荡仪
• 去离子水

试剂准备

Working ReagentⅠ：临用前配制；对于 48 T试剂盒，加入 1.75 mL去离子水充分溶解粉剂；对于 96 T试剂盒，加入 3.5 mL去离子水，充分溶解粉剂；未用完的试剂-20℃避光分装可保存 2周，避免反复冻融。

ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Working ReagentⅢ：临用前配制；对于 48 T试剂盒，加入 3 mL去离子水充分溶解粉剂；对于 96 T试剂盒，加入 6 mL去离子水，充分溶解粉剂；未用完的试剂 4℃避光可保存 1个月。

Working ReagentⅣ：临用前配制；按照Working ReagentⅢ:ReagentⅣ=1:1充分混匀，根据实验用量按需配制，现用现配。

ReagentⅤ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅥ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

ReagentⅦ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Standard：临用前配制；加入 1 mL ReagentⅦ充分溶解，配制成 5 mg/mL乙酰胆碱储备液；-20℃避光分装可保存 1个月，避免反复冻融。

500 μg/mL Standard：取 20 μL 5 mg/mL乙酰胆碱储备液，加入 180 μL去离子水充分混匀，限当天使用。

注意：ReagentⅠ，ReagentⅡ，ReagentⅢ和 Standard均有一定毒性，建议在通风橱进行实验。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 全血样本：取 200 μL肝素抗凝新鲜全血，加入 350 μL去离子水混合使溶血，加 50 μL Working ReagentⅠ，缓慢加入 200 μL ReagentⅡ，充分混匀，3,500 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 血清样本：取 200 μL血清，加 50 μLWorking ReagentⅠ，缓慢加入 200 μL ReagentⅡ，充分混匀，3,500 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：

于涡旋振荡仪混匀 1 min，取 200 μL上层液转移至 96孔板，测定 540 nm处吸光值，分别记为 A 空白，A 标准，A 测定和 A 对照，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次，每个测定管均需设置一个对照管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.02，可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.4，上清液可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

乙酰胆碱含量的计算：

（1）按全血体积：

Ach (μg/mL)=ΔA 测定÷ΔA 标准×C 标准×4=ΔA 测定÷ΔA 标准×200

（2）按血清体积：

Ach (μg/mL)=ΔA 测定÷ΔA 标准×C 标准×2.25=ΔA 测定÷ΔA 标准×112.5

C 标准：标准品终浓度，50 μg/mL；4：对全血初始稀释倍数；2.25：对血清初始稀释倍数。