硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 240 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡至室温；4℃保存。

Substrate：即用型；使用前，平衡至室温；-20℃避光保存。

H2O2：即用型；使用前，平衡至室温；4℃避光保存。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mLAssay Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞、细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mLAssay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清等液体的准备：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 240 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Substrate置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 30 min。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中加样，每孔先加入 4 μL上清液，再加入 180 μL Substrate，最后加入 16 μL H2O2，轻柔晃动孔板，使各组分混合均匀。
4. 测定 240 nm处的吸光值，分别记录 10 s和 130 s吸光值，记为 A1和 A2，计算ΔA=A1-A2。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV微孔板测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

活性单位(U)定义：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1 nmol H2O2降解。

TPX 活性(U/mg prot)=1,147×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

活性单位(U)定义：25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1 nmol H2O2降解。

TPX 活性(U/g 鲜重)=1,147×ΔA÷W

3. 细胞或细菌数量计算

活性单位(U)定义：25℃或者 37℃中，每 104个细胞或细菌每分钟催化 1 nmol H2O2降解。

TPX 活性(U/104)=2.294×ΔA

4. 按液体体积计算

活性单位(U)定义：25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化催化 1 nmol H2O2降解。

TPX 活性(U/mL)=1,147×ΔA

Ε：H2O2摩尔消光系数，43600 L/mol/cm=0.0436 mL/nmol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，200 μL=0.2 mL； Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，4 μL=4×10-3 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；500：细胞或细菌数量，5×106。

B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。