二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm 处的吸光度）
• 96 孔 UV 板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction BufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Extraction BufferⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working ReagentⅡ：临用前配制，对于 48 T，加 5.5 mL ReagentⅠ溶解；对于 96T，加 11 mL ReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存 2 周，避免反复冻融。
• Working ReagentⅢ：临用前配制，对于 48 T，加 5.5 mL ReagentⅠ溶解；对于 96T，加 11 mL ReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存 2 周，避免反复冻融。
• Working ReagentⅣ：临用前配制，对于 48 T，加 0.6 mL ReagentⅠ溶解；对于 96T，加 1.2 mL ReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存 2 周，避免反复冻融。
• Working Solution：临用前将 Working ReagentⅡ和Working ReagentⅢ按 1: 1 混合，根据实验需求配制相应的体积。现用现配。

样本制备

粗酶液制备：

1. 总 Rubisco 酶提取：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction BufferⅠ，冰浴匀浆，超声波破碎 1 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 胞浆和叶绿体 Rubisco 酶的分离：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction BufferⅠ，冰浴匀浆，200 g，4℃离心 5 min，弃沉淀，取上清，8,000 g，4℃离心 10 min，离心后取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1 mL Extraction BufferⅡ，震荡溶解后超声破碎 1 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96 孔 UV 板或微量石英比色皿中操作）：

迅速混匀后于 340 nm 检测，记录 20 s 和 5 min 20 s 的吸光值，测定孔的记为 A1和 A2，空白孔的记为 A3和 A4，计算 ΔA 测=(A1-A2)-(A3-A4)。

结果计算

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中，每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1 nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本质量计算

单位的定义：25℃中，每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1 nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=2×10^-4 L，V 提取：提取液体积，1 mL；V 样本：反应体系中上清液体积，0.01 mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔 UV 板直径，0.5 cm；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，5 min；W：样本质量，g。

A. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。