精氨酸(Arg)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 525 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水、PBS、无水乙醇
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction BufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Extraction Buffer II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Working Reagent II：临用前配制；48 T每瓶 Reagent II 加入 682.5 µL无水乙醇和 17.5 µL Reagent III，96 T每瓶 Reagent II 加入 1,365 µL无水乙醇和 35 µL Reagent III，充分溶解待用。现配现用。
• Reagent III：即用型；4℃避光保存。

注意：Working Reagent II 和 Reagent III 有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

Standard：临用前配制；加入 1 mL去离子水充分溶解，即 50 µmol/mLArg标准品；使用前，平衡到室温。4℃保存一个月。使用 50 µmol/mLArg标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction BufferⅠ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 10 min，取 800 µL上清液，缓慢加入 150 µL Extraction Buffer II 混匀，12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction BufferⅠ，冰浴超声波破碎细菌或细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），12,000 g，4℃离心 10 min，取 800 µL上清液，缓慢加入 150 µL Extraction Buffer II 混匀，12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
3. 血清（浆）等液体样本：取 100 µL样本，加入 1 mL Extraction BufferⅠ混匀，12,000 g，4℃离心 10 min，取 800 µL上清液，缓慢加入 150 µL Extraction Buffer II 混匀，12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。因Extraction BufferⅠ和 Extraction Buffer II 会导致蛋白变性，样本需另行用去离子水按照步骤提取。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 525 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

3. 混匀，30°C 孵育 20 min，记录 525 nm处吸光值。空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 1,000 nmol/mL的ΔA 标准，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (nmol/mL)。
2. Arg含量的计算：

• （1）按蛋白浓度计算
  Arg (nmol/mg 蛋白)=V 样×x÷(V 样×Cpr)×F=x÷Cpr×F
• （2）按样本鲜重计算：
  Arg (nmol/g 鲜重)=(V 上清+V 提 II)×x÷(w×V 上清÷V 提Ⅰ)×F=1.1875x÷w×F
• （3）按细菌或细胞数量计算：
  Arg (nmol/106)=(V 上清+V 提 II)×x÷(n×V 上清÷V 提Ⅰ)×F=1.1875x÷n×F
• （4）按液体体积计算
  Arg (nmol/mL)=(V 上清+V 提 II)×x÷[V 液体×V 上清÷(V 液体+V 提Ⅰ)]×F=13.0625x÷n×F

V 样：加入反应体系中样本体积，0.05 mL；V 上清：提取时上清的体积，0.8 mL；V 提Ⅰ：加入 Extraction BufferⅠ的体积，1 mL；V 提 II：加入 Extraction Buffer II 的体积，0.15 mL；V 液体：液体样本的体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细菌或细胞数量，以 106计；F：样本稀释倍数。