腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：Extraction Buffer有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；将 Reagent II B转移至 Reagent IIA瓶中，48 T加入 5 mL去离子水，96 T加入 10 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent III：临用前配制；48 T加入 0.8 mL去离子水，96 T加入 1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent IV：临用前配制；48 T加入 0.8 mL去离子水，96 T加入 1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent V：临用前配制；48 T加入 0.8 mL去离子水，96 T加入 1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent：每孔准备 35 µL工作液，现配现用。按 Reagent III：Reagent IV：Reagent V=1：1：1的比例配制，混合均匀。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

2. 该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1372的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ置于 30℃孵育 10 min。
3. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中操作）：

混匀，30℃保温 15 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，4,000g，4℃离心 5 min，取上清液。下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作：

4. 充分混匀，立即记录 340 nm处 10 s时吸光值 A1和 130 s时的吸光值 A2。计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.02可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.6，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含 AGP或已降解。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

AGP活性的计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L /mol /cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；1.75：稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。

注意事项

1. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中的操作，建议使用冷却至室温的 ReagentⅠ，否则将会造成读数背景高。