糖原磷酸化酶a(GPa)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent：临用前配制；将 Reagent II 全部转移至 Reagent I 中，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent III：临用前配制；48 T加入 0.6 mL去离子水，96 T加入 1.2 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入 0.6 mL去离子水，96 T加入 1.2 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌和细胞：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

3. 充分混匀，记录 340 nm处 10 s时吸光值 A1，37℃反应 10 min记录 610 s时的吸光值 A2。计算ΔA=A2-A1。

结果计算

GPa活性的计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

(3) 按细菌或细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

(4) 按样本体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L /mol /cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细菌或细胞数量，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。