黄嘌呤氧化酶(XOD)活性分析试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 450 nm处的吸光度）及水浴锅
• 96孔板或微量玻璃比色皿
• 低温离心机、水浴锅
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 50 mM磷酸盐缓冲液（按 0.05 mol/L K2HPO4：0.05 mol/L KH2PO4= 80.2：19.8的比例配制; pH 7.4) 、EDTA、Triton X-100
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Sample Diluent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• WST-8：即用型；使用前，冰上避光放置；分装保存于-20℃避光保存。
• Enhancer：即用型；使用前，冰上避光放置；分装保存于-20℃避光保存。
• Xanthine：即用型；使用前，冰上放置；分装保存于-20℃。

Working Reagent：对于 96孔板，每孔准备 85 µL工作液，现配现用。工作液配比：74 µLAssay Buffer，5 µL Xanthine, 5 µLWST-8, 1 µL Enhancer。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL 裂解液（50 mM磷酸盐缓冲液，0.1 mM EDTA，0.5% Triton X-100），冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL裂解液（50 mM磷酸盐缓冲液，0.1 mM EDTA，0.5% Triton X-100）捣碎，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入 1 mL 裂解液（50 mM磷酸盐缓冲液，0.1 mM EDTA，0.5%Triton X-100），冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清或血浆：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

3. 混匀，室温（25℃）避光孵育 30 min，于 450 nm检测，空白孔记为 A 空，测定孔记为 A 测，计算ΔA 测=A 测-A 空。

结果计算

1. 标准曲线公式: y=574.46x+8.2497，R² = 0.9995，其中，x代表ΔA 标，y代表黄嘌呤氧化酶标准品浓度（mU/mL）。
2. 样本 XO浓度的计算：

将样本的ΔA 测代入方程得到 y值 (mU/mL)。

1. 按样本鲜重计算

XO 活性(mU/g 鲜重)=y×V 样÷(W×V 样÷V 样总) ×n=y÷W×n

2. 按样本体积计算

XO 活性(mU/mL)=y×V 样÷V 样×n=y×n

3. 按细胞或细菌数量计算

XO 活性(mU/10⁴)=y×V 样÷(细胞或细菌数量×V 样÷V 样总)×n=y÷500×n

参数说明：

• V 样：加入样本体积，0.02 mL
• W：样本质量，g
• V 样总：加入 Assay Buffer体积，1 mL
• n：样本稀释倍数
• 500：细胞或细菌总数，500万