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活动截止时间：2024年1月31日
CheKine™ 海藻糖酶（THL）活性检测试剂盒（微量法）是一款基于比色法的微量检测工具，可在 96 孔板体系内快速测定细胞、组织或液体样本中海藻糖酶（Trehalase, THL）的活性，为细胞代谢研究提供可靠数据。
海藻糖酶（EC 3.2.1.28）广泛分布于动物、植物、微生物及培养细胞中，负责将海藻糖水解为两分子葡萄糖，从而直接参与能量代谢。CheKine™ 海藻糖酶活性检测试剂盒（微量法）通过以下级联反应实现定量：THL 首先催化海藻糖生成葡萄糖；随后葡萄糖氧化酶（GOD）将葡萄糖氧化为葡萄糖酸并释放过氧化氢；在过氧化物酶（POD）作用下，过氧化氢进一步氧化 4-氨基安替比林与酚的偶联底物，形成在 505 nm 处具有特征吸收的红色醌类化合物。505 nm 吸光度的变化与 THL 活性成正比，可在标准曲线辅助下计算样本酶活。
该试剂盒主要用于细胞代谢研究，可评估培养细胞、原代细胞或模式生物在应激、药物处理、基因编辑等条件下海藻糖酶活性的动态变化，亦可拓展至植物抗逆机制、微生物能量代谢及食品发酵过程监控等方向。
| 中文名称 | 海藻糖酶(THL)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™ |
| 英文名称 | CheKine™ Micro Trehalase (THL) Activity Assay Kit |
| 产品货号 | KTB1336 |
| 检测方法 | 比色法 |
| 试剂盒组分 | •Extraction Buffer •Reagent I •Reagent Ⅱ •Reagent Ⅲ •Reagent Ⅳ •Standard |
| 分子 | THL |
| 检测指标 | THL |
| 注意事项 | •推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存数周。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。 •实验开始前，确保所有的组分及设备处于合适的温度。 |
| 保存建议 | -20℃，避光保存 6 个月 |
| 运输条件 | 冰袋运输（蓝冰） |
| 警告 | 本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。 |
注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Working Reagent I：临用前配制；48 T 加入 4.2 mL 去离子水，96 T 加入 8.4 mL 去离子水，充分溶解待用。4℃避光保存可稳定 2 周。
Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Working Reagent III：临用前配制；48 T 加入 7.5 mL Reagent II，96 T 加入 15 mL Reagent II，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1 个月，避免反复冻融。
Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
注意：Reagent III 有毒，Reagent IV 有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
Working Reagent：每孔准备 180 µL 工作液，现配现用。将 Working Reagent III 和 Reagent IV 按照 1：1 等体积混匀待用。
Standard：临用前配制；加入 1 mL 去离子水充分溶解，配制成 10 mg/mL 葡萄糖标准品；4℃避光保存可稳定 2 周。使用 10 mg/mL 葡萄糖标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：
| 序号 | Standard 体积（μL） | 去离子水体积（μL） | 浓度（mg/mL） |
|---|---|---|---|
| Std.1 | 100 μL of 10 mg/mL Standard | 900 | 1 |
| Std.2 | 160 μL of Std.1 (1 mg/mL) | 40 | 0.8 |
| Std.3 | 120 μL of Std.1 (1 mg/mL) | 80 | 0.6 |
| Std.4 | 80 μL of Std.1 (1 mg/mL) | 120 | 0.4 |
| Std.5 | 40 μL of Std.1 (1 mg/mL) | 160 | 0.2 |
| Blank | 0 | 200 | 0 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h 之内使用。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h 内完成样品解冻。
1. 组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
2. 细胞或真菌：收集 500 万细胞或真菌到离心管内，用冷 PBS 清洗细胞或真菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或真菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
3. 血清（浆）等液体样本：量取约 0.1 mL 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）进行样本蛋白质浓度测定。
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 505 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. Working Reagent 置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 10 min。
3. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP 管中操作）：
| 试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
|---|---|---|---|---|
| 样本 | 0 | 0 | 30 | 30 |
| Standard | 0 | 30 | 0 | 0 |
| 去离子水 | 30 | 0 | 0 | 50 |
| Working ReagentⅠ | 50 | 50 | 50 | 0 |
45℃水浴准确反应 15 min 后，95℃水浴 5 min 终止反应，10,000 g，4℃离心 10 min 后取上清。下述操作在 96 孔板或微量玻璃比色皿中操作:
| 试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
|---|---|---|---|---|
| 上清 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Working Reagent | 180 | 180 | 180 | 180 |
4. 充分混匀，混合液置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 15 min，记录 505 nm 处吸光值，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定，对照孔记为 A 对照。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。
注意：空白管和标准管只需做 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果 ΔA 测定小于 0.05 可适当加大样本量。如果 ΔA 测定大于 1.0，样本可用 Extraction Buffer 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为 x 轴，ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (mg/mL)。
2. THL 活性的计算：
（1）按蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL (U/mg 蛋白)=(V 反总×x)÷(V 样×Cpr)÷T×1,000=177.78x÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL (U/g 鲜重)=(V 反总×x)÷(V 样×W÷V 样总)÷T×1,000=177.78x÷W
（3）按照真菌或细胞数量计算
单位的定义：每 104真菌或细胞每分钟催化产生 1 μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL (U/104)=(V 反总×x)÷(V 样×n÷V 样总)÷T×1,000=177.78x÷n
（4）按样本体积计算：
单位的定义：每 mL 液体每分钟催化产生 1 μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL (U/mL)=(V 反总×x)÷(V 样×V 液÷V 样总)÷T×1,000=1,777.78x
V 反总：反应体系总体积，80 μL=0.08 mL；V 样：加入反应体系中样本体积，30 μL=0.03 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；V 液：加入血清（浆）等液体样本体积，0.1 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1,000：1 mg/mL=1,000 µg/mL；n：真菌或细胞总数，以万计。
A: 动物研究，植物研究，微生物研究等相关单位都应用比较多。
A: 生化试剂盒已充分验证，适合于植物、动物和微生物等多种物种。 对于在植物、动物和微生物等不同材料之间确实存在很大差异的指标，尤其是酶活性测定指标，我们分别研发和生产了针对同一指标的不同类型试剂盒，并在试剂盒名称和代号上做了明确区分，请用户仔细核对，选择合适的试剂盒类型。如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
A: 不建议用，分光光度计每次检测的样本个数不超过4个，无法做到数据检测的同步。
A: 检测孔的数量=样本个数+标准品数×重复次数+预留补测数量，如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
A: 可以，用超声进行破碎微生物细胞，再进行细胞上清的检测，如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
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