ATP柠檬酸裂解酶(ACL)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 340 nm 处的吸光度）
• 96 孔 UV 板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL 离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

注意：Extraction Buffer 和 Reagent I 有少许刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Note: Extraction Buffer and Reagent I have a slight irritating odor, so it is recommended to experiment in a fume hood.

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Working Reagent：临用前配制；将 Reagent II 和 Reagent III 转移至 ReagentⅠ中，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1 个月，避免反复冻融。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h 内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌和细胞：收集 500 万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS 清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30 次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 340 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 将 Working Reagent 在 37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）预热 5 min。
3. 操作表（下述操作在 96 孔 UV 板或微量玻璃比色皿中操作）：

4. 混匀，立即记录 340 nm 处 20 s 时的吸光值 A1和 320 s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 小于 0.02 可适当加大样本量或延长反应时间。如果ΔA 大于 0.4，样本可用 Extraction Buffer 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

ACL 活性的计算：

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(U /mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643.08×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活性单位。

ACL(U /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=643.08×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 10⁴个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活性单位。

ACL(U /10⁴)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(n×V 样÷V 样总)÷T=643.08×ΔA÷n

4. 按液体体积计算

单位的定义：每 mL 液体每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活性单位。

ACL(U /mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=643.08×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 的体积，1 mL；T：反应时间，5 min；W：样本质量，g；n：细胞总数，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。