丙酮酸羧化酶(PC)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

注意：Extraction Buffer有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。

Reagent IV：临用前配制；48 T加入 0.6 mL去离子水，96 T加入 1.2 mL去离子水，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent：临用前配制；用 ReagentⅠ溶解 Reagent II 和 Reagent III，将溶解后的 Reagent II 和 Reagent III 转移到 ReagentⅠ中，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

动物组织或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：称取约 0.1 g样本或收集 500万细胞，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆。将匀浆 600 g，4℃离心 5 min，弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11,000 g，4℃离心 10 min，上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 PC（可选做）。沉淀即为线粒体，加入 1 mL Extraction Buffer，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30次），用于线粒体 PC 测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 将Working Reagent置于 37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）预热 5 min。

3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量玻璃比色皿中进行）：

迅速混匀后，记录 340 nm处 10 s时吸光值 A1和 130 s时的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量或延长反应时间。如果ΔA大于 0.5，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

PC活性的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH为 1个酶活单位。

PC 上清(U/mg prot)=[ΔA 上清×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=3,216×ΔA 上清÷Cpr
PC 沉淀(U/mg prot)=[ΔA 沉淀×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=3,216×ΔA 沉淀÷Cpr
总 PC(U /mg prot)=PC 上清+PC 沉淀=3,216×ΔA 上清÷Cpr+3,216×ΔA 沉淀÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟消耗 1 nmol NADH为 1个酶活单位。

PC 上清(U/g 鲜重)＝[ΔA 上清×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=3,216×ΔA 上清÷W
PC 沉淀(U/g 鲜重)＝[ΔA 沉淀×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=3,216×ΔA 沉淀÷W
总 PC(U /g 鲜重)=PC 上清+PC 沉淀=3,216×ΔA 上清÷W+3,216×ΔA 沉淀÷W

（3）按细胞数量计算：

酶活单位定义：每 10⁴细胞每分钟消耗 1 nmol NADH为 1个酶活单位。

PC 上清(U/10⁴ cell)＝[ΔA 上清×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(n×V 样÷V 样总)÷T=3,216×ΔA 上清÷n
PC 沉淀(U/10⁴ cell)＝[ΔA 沉淀×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(n×V 样÷V 样总)÷T=3,216×ΔA 沉淀÷n
总 PC(U /10⁴ cell)=PC 上清+PC 沉淀=3,216×ΔA 上清÷n+3,216×ΔA 沉淀÷n

ΔA 上清：上清测定值；ΔA 沉淀：沉淀测定值；ε：NADH在 340 nm处摩尔吸光系数，6.22×10³L/mol /cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，2 min；n：细胞总数，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。