ATP含量检测试剂盒(发光法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 细胞培养板、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、96孔全黑酶标板或全白酶标板
• 发光检测仪或多功能酶标仪

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；置于冰上待用；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：Assay Buffer有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

Reaction Buffer：临用前配制，用 Assay Buffer 溶解 Firefly Luciferase Substrate，然后将溶解后的 Firefly Luciferase Substrate和 Luciferase加入 Assay Buffer瓶中，充分混匀后按使用需求分装，并避光保存于-20℃；使用前，平衡到室温。

注意：Reaction Buffer不能反复冻融，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格，-20℃避光保存，推荐 3个月内使用，-80℃避光保存，12个月内有效。

ATP Standard (5 mM)：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃，避光保存

100 μM ATP Standard：临用前配制，取 20 μL ATP Standard (5 mM) 加入 980 μL Extraction Buffer，充分混匀，置于冰上待用。

标准曲线设置：用 Extraction Buffer把 100 μM ATP Standard稀释成适当的浓度梯度，具体的浓度需根据样品中 ATP的浓度而定。

初次检测可以设置 0、0.001、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和 10 µM这几个浓度，在后续的实验中，可以根据样品中 ATP的浓度对标准品的浓度范围进行适当调整。

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

1. 血清（浆）样本：按照 0.1 mL血清（浆）加入 0.9 mL Extraction Buffer的比例，使用移液器反复吹打充分混匀，12,000 g，4℃离心 5 min，取上清，置冰上待测。
2. 动物或植物组织样本：按照 0.1 g组织加入 1 mL 的 Extraction Buffer的比例，冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 5 min，取上清，置冰上待测。
3. 贴壁细胞样本：吸弃培养液，按照 6孔板每孔加入 200 μL Extraction Buffer的比例加入裂解液，使用移液器进行反复吹打或晃动培养板使 Extraction Buffer充分接触并裂解细胞，12,000 g，4℃离心 5 min，取上清，置冰上待测。
4. 悬浮细胞样本：收集 500万个细胞到离心管内，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，使用移液器进行反复吹打裂解细胞，12,000 g，4℃离心 5 min，取上清，置冰上待测。
5. 细菌样本：收集 500万个细菌到离心管内，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌 1 min（功率 20%或 200 W，超声 2 s，间隔 1 s，重复 20 次），12,000 g，4℃离心 5 min，取上清，置冰上待测。

(1) ATP，特别是裂解后样品中的 ATP在室温不太稳定，需在 4℃或冰上操作，提取后的样本需要在 6 h以内检测完。
(2)使用本试剂盒中的 Extraction Buffer裂解获得的细胞或组织样品，不仅可以用于 ATP检测，还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些常规的较易溶解蛋白的Western检测，如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 在 96孔全黑酶标板或全白酶标板各检测孔中加入 100 μL Reaction Buffer。室温放置 3-5 min，以使本底性的 ATP全部被消耗掉，从而降低本底。可以一次性把 10-20个检测孔分别加入 100 μL Reaction Buffer，从而节省时间。
2. 在各检测孔中加入分别 20 μL样品或标准品，迅速混匀后，立即于发光检测仪或多功能酶标仪中检测化学发光值。

(1)一次性检测孔（包括标准孔）的数量需控制在 20个以下。
(2)实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，根据预实验的结果，适当调整标准品浓度。
(3)样品的体积可以自行在 10-100 μL范围内调节。如果样品中的 ATP浓度比较低则可以加入 100 μL样品，如果样品中 ATP浓度比较高则可以加入较小体积的样品，同时标准品也需要使用相同的体积。如果样品中 ATP的浓度特别高，可以用 Extraction Buffer稀释样品后再测定。本试剂盒在加入 10-100 μL标准品时，大致在 1 nM-10 µM的浓度范围内有很好的线性关系。
(4)对于一些特殊的组织或样品，如果发现检测出来的 ATP水平显著低于预期水平，可以在裂解样品后并且在离心前，取部分样品煮沸 2 min以充分释放 ATP。煮沸后样品中的蛋白会变性，从而会在后续的离心步骤中被沉淀，因此煮沸的样品不能用于蛋白浓度测定、SDS-PAGE和Western检测。可以使用剩余的部分样品进行蛋白浓度测定、SDS-PAGE和Western检测。

注意事项

1. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时，试剂均需达到室温后再进行检测。
2. 用移液器混匀时，要小心吸打，避免产生气泡。
3. 检测时需使用全黑色或白色的 96孔板，防止相邻孔的干扰。
4. 萤火虫荧光素酶催化的生物发光的最强波长为 560 nm。

结果计算

所有测定孔和标准孔的化学发光 RLU值减去空白孔的化学发光 RLU值，即ΔRLU 标=RLU 标-RLU 空，ΔRLU 测=RLU 测-RLU 空。

1. 标准曲线的绘制

以标准品浓度为 y轴，ΔRLU 标为 x轴，绘制标准曲线，将ΔRLU 测代入标准曲线来计算样本中 ATP的浓度 y (nM)。

2. 含量计算

1,000：1 nM=10^-3 nmol/mL；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样提：提取时加入液体样本体积，0.1 mL；V 样总：样本总体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，0.1 g；500：细胞数量，5×10⁶；n：稀释倍数。