IHC专题| 疑难解答
Abbkine IHC系列产品组合提供包括：通用型免疫荧光（IF）工具箱、HRP/AP偶联二抗，兼容性好抗荧光效果强的抗荧光淬灭剂等。为广大用户IHC实验提供多种选择。
我们对大家日常IHC实验中遇到的问题进行了汇总，并提供了一些解决方案，希望能够帮助大家顺利做出实验，得到较好的实验结果。话不多说，直接上干货！
疑难问题一
没有染上色，可能的原因有：
- 一抗和二抗不匹
建议：使用针对一抗种属来源的二抗。如，一抗来源于小鼠，使用抗小鼠的二抗。
- 一抗浓度偏低，结合目的蛋白较少
建议： 提高抗体的工作浓度，4 ℃过夜孵育。
- 一抗、二抗可能由于储存不当、稀释不当或反复冻融而失活
建议：使用阳性对照来确保一抗/二抗的有效性。
- 检测组织中不存在目的蛋白
建议：使用抗体供应商推荐的阳性对照。
- 组织中目标蛋白丰度不够
建议：利用放大步骤将信号最大化。例如，使用生物素偶联二抗和偶联酶的链霉亲和素。
- 荧光二抗未避光储存
建议：始终避免二抗暴露在光下。
- 脱蜡不充分
建议：延长切片脱蜡时间，使用新配制的二甲苯。
- 固定过程（使用福尔马林和多聚甲醛固定剂）可能改变了抗体识别的表位
建议：使用不同的抗原修复方法来使表位暴露，包括用 pH 6 或 pH 9 缓冲液的热抗原修复法、酶抗原修复法等，或缩短切片固定时间。
- 蛋白位于核内，抗体（核蛋白）不能进入细胞核
建议：向封闭缓冲液和抗体稀释缓冲液中加入强透化剂，例如 Triton X。
- PBS 缓冲液被细菌污染，破坏了目标蛋白上的磷酸基团
建议：在 PBS 抗体储存缓冲液中加入 0.01% 叠氮化物或使用新配制的无菌 PBS。
疑难问题二
背景偏高，可能的原因有：
- 可能未封闭非特异性结合，或封闭不充分
建议：延长封闭孵育时间，考虑更换封闭剂。推荐使用二抗种属来源的10% 正常血清封闭1小时，或使用1-5% BSA 封闭细胞样本30分钟。
- 一抗浓度可能过高
建议：将抗体滴定到最佳浓度，进一步稀释抗体并在 4 ℃ 下孵育。
- 孵育温度可能过高
建议： 4 ℃ 下孵育切片或细胞。
- 二抗可能非特异性结合
建议：使用不加一抗的二抗对照。
- 组织洗涤不充分，仍含有固定剂
建议：在所有步骤之间用 PBS 充分洗涤。
- 内源过氧化物酶有活性
建议：使用酶抑制剂，例如用 Levamisol (2mM) 抑制碱性磷酸酶，或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制过氧化物酶。
- 固定过程（使用福尔马林或多聚甲醛固定剂）引起自发荧光（如果检测系统是免疫荧光）
建议：福尔马林/PFA 通常会在绿光光谱内产生自发荧光，尝试使用红光范围内的荧光素。如果有红外检测系统，使用红外区的荧光素。
- 过度放大（放大技术）
缩短孵育时间，稀释二抗或信号放大试剂盒。
- 底物过多（酶检测）
建议：进一步稀释底物，缩短底物孵育时间。
- 色原与细胞//组织中的 PBS 反应（酶检测）
建议：在底物孵育切片/细胞前后使用Tris 缓冲液洗涤切片/细胞
- 透化破坏了细胞膜并去除了膜蛋白（膜蛋白）
建议：使用较温和的去垢剂（例如，用 Tween 20 代替 Triton X）。或去除缓冲液中的透化剂。
Abbkine IHC系列二抗，满足多种样本种属需求，助力您的IHC实验！
产品推荐：
| 货号 | 名称 | 规格 |
| BMU104-CN | SuperKine™ 增强型抗荧光淬灭剂 | 10 mL/50 mL |
| BMU107-CN | SuperKine™ 增强型抗荧光淬灭剂（含DAPI） | 10 mL/50 mL |
| KTD107-CN | 通用型免疫荧光（IF）工具箱（抗兔Dylight 488） | 100T |
| KTD108-CN | 通用型免疫荧光（IF）工具箱（抗小鼠Dylight 488） | 100T |
| KTD109-CN | 通用型免疫荧光（IF）工具箱（抗兔Dylight 594） | 100T |
| KTD110-CN | 通用型免疫荧光（IF）工具箱（抗小鼠Dylight 594） | 100T |
| A21010 | 山羊抗小鼠IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21020 | 山羊抗兔IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21030 | 兔抗山羊IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21050 | 山羊抗人IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21040 | 山羊抗大鼠IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21110 | 山羊抗小鼠IgG二抗，AP碱性磷酸酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21120 | 山羊抗兔IgG二抗，AP碱性磷酸酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21090 | 山羊抗猪IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21080 | 山羊抗鸡IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21060 | 驴抗绵羊IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
| A21070 | 山羊抗豚鼠IgG二抗，HRP辣根过氧化物酶标记 | 100 μL/500 μL |
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