糖化酶活性检测试剂盒实验解决方案

原理   糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶。糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。多应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。CheKine™ 糖化酶活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织，细菌和培养细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，糖化酶将可溶性淀粉生成葡萄糖，碱性条件下，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后生成红棕色化合物，在540 nm处有最大光吸收，在一定范围内葡萄糖的量与反应液颜色深浅成正比，以此测定糖化酶的活性。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测540 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。（若出现沉淀，可以90℃加热5 min溶解后使用）Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：Reagent II有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。Standard：临用前配制；加入1 mL Extraction Buffer溶解，配制成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，4℃保存2周。标准品制备：使用10 mg/mL葡萄糖标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号		Standard体积（μL）		去离子水体积（μL）		浓度（mg/mL）
Std.1	200 μL 10 mg/mL Standard		800		2.0
Std.2	150 μL of Std.1 (2.0 mg/mL)		50		1.5
Std.3	300 μL of Std.1 (2.0 mg/mL)		300		1.0
Std.4	320 μL of Std.3 (1.0 mg/mL)		80		0.8
Std.5	200 μL of Std.4 (0.8 mg/mL)		200		0.4
Std.6	200 μL of Std.5 (0.4 mg/mL)		200		0.2
Std.7	200 μL of Std.6 (0.2 mg/mL)		200		0.1

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2.细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞3 min（功率30%或300 W，超声3 s，间隔7 s），然后10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3.血清（浆）等液体样本：直接检测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在1.5 mL离心管中操作）：

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）	对照孔（μL）
样本	0	0	10	0
灭活样本	0	0	0	10
Standard	0	10	0	0
去离子水	10	0	0	0
ReagentⅠ	100	100	100	100
充分混匀，放入40℃水浴20 min
Reagent II	90	90	90	90

3.充分混匀，沸水浴5 min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，取200 μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，记录540 nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。注意：空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.05可适当加大样本量。如果ΔA测定大于2 mg/mL的ΔA标准，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。蛋白含量较高的样本建议用Extraction Buffer稀释后再进行处理及检测。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。2.糖化酶活性的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。糖化酶(U/mg prot)=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T=5.5x÷Cpr（2）按样本鲜重计算：酶活单位定义：在40℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。糖化酶(U/g 鲜重)=x×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=5.5x÷w（3）按照细菌或细胞数量计算酶活单位定义：在40℃，pH4.6条件下，每104个细菌或细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。糖化酶(U/104)=x×V反总÷(V样×n÷V样总)÷T=0.55x÷n（4）按样本体积计算：酶活单位定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫升液体每分钟分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。糖化酶(U/mL)=x×V反总÷V样÷T=0.55xV反总：反应总体积，0.11 mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，20 min；n：细菌或细胞数量，万。