羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒实验解决方案

原理羟脯氨酸（HYP）是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。CheKine™ 羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒（微量法）可检测动物组织，细菌和培养细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，样本经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560 nm处有特征吸收峰。通过测定样本水解液560 nm吸光值，可计算HYP含量。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测560 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管、玻璃管·水浴锅、离心机、烘箱·去离子水、浓盐酸、无水乙醇、异丙醇、氢氧化钠
试剂准备Tissue Extraction Buffer：即用型；6 mol/L盐酸，浓盐酸：去离子水（V/V）=1:1，室温保存。（自备）Cell Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：本试剂盒组分均有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。Standard：即用型；0.5 mg/mL L-羟基脯氨酸标准品；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。标准品制备：使用0.5 mg/mL L-羟基脯氨酸标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号		Standard体积（μL）		去离子水体积（μL）		浓度（μg/mL）
Std.1	24 μL 0.5 mg/mL Standard		376		30
Std.2	200 μL of Std.1 (30 μg/mL)		200		15
Std.3	200 μL of Std.2 (15 μg/mL)		200		7.5
Std.4	200 μL of Std.3 (7.5 μg/mL)		200		3.75
Std.5	200 μL of Std.4 (3.75 μg/mL)		200		1.875
Std.6	200 μL of Std.5 (1.875 μg/mL)		200		0.938
Std.7	200 μL of Std.6 (0.938 μg/mL)		200		0.469
Std.8	200 μL of Std.7 (0.234 μg/mL)		200		0.234

样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.动物组织：称取约0.2 g样品于玻璃管，加入2 mL Tissue Extraction Buffer，置于110℃烘箱，水解6-12 h，冷却后用氢氧化钠溶液调节ph为7.0左右，用去离子水定容至4 mL，12,000 g，25℃，离心20 min，取上清待测。2.细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，加入1 mL Cell Extraction Buffer，于高压消毒器中15磅保持30 min，自然降压后用浓盐酸调节ph为7.0左右，用去离子水定容至2 mL，12,000 g，25℃，离心20 min，取上清待测。3.血清中游离HYP提取：取0.1 mL血清，加入0.5 mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8,000 g，4℃离心5 min。将上清倒入另一个EP管，氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入0.2 mL 50%异丙醇，充分溶解混匀待测。注意：(1) 如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。(2)提取过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质，不影响实验。实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到560 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。操作表（下述操作在1.5 mL离心管中操作）：

试剂	空白管（μL）	标准管（μL）	测定管（μL）
样本	0	0	60
Standard	0	60	0
ReagentⅠ	60	60	60
混匀，室温静置20 min
Reagent II	60	60	60
去离子水	180	120	120

3.充分混匀，60℃反应20 min，取出后室温静置15 min，取200 μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，记录560 nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定。计算ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。注意：空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测定大于30 μg/mL的ΔA标准，样本可用相应提取液一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA测定带入方程得到x (µg/mL)。2.HYP含量的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：HYP(µg/mg prot)=x×V样÷(Cpr×V样)=x÷Cpr（2）按样本鲜重计算：HYP(µg/g 鲜重)=x×V反总÷(V样÷V组总×W)=20x÷W（3）按照细菌或细胞数量计算HYP(µg/104)=x×V反总÷(V样÷V胞总×n)=10x÷n（4）按样本体积计算：HYP(µg/mL)=x×V反总÷(V样本÷2)=10xV反总：反应总体积，0.3 mL；V样：反应中样品体积，0.06 mL；V组总：加入组织的提取液体积，4mL；V胞总：加入细菌或细胞的提取液体积，2mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本重量，g；n：细菌或细胞数量，万；2：血清吹干后复溶的倍数。