萤火虫荧光素酶检测试剂盒实验操作步骤

原理

在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，萤火虫荧光素酶（Luciferase, Firefly luciferase）可以催化萤火虫荧光素（Luciferin）生成氧化荧光素（Oxyluciferin），在荧光素被氧化的过程中，会产生光信号。通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5'-启动子区克隆在Luciferase的上游，或把3'-UTR区克隆在Luciferase的下游，构建成报告基因（Reporter gene）质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，通过检测荧光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。萤火虫荧光素酶检测试剂盒以萤火虫荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶活性，该试剂盒具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广等特点。

自备耗材

·细胞培养板、可调节式移液枪及枪头

·去离子水，PBS

·低温离心机、96孔全黑酶标板或全白酶标板

·发光检测仪或多功能酶标仪

试剂准备

Lysis Buffer：临用前配制，内含不溶物，摇匀后使用，用去离子水将Lysis Buffer (5×) 稀释5倍得到Lysis Buffer，-20℃保存。

Firefly Luciferase Solution：临用前配制，用Firefly Luciferase Assay Buffer溶解Firefly Luciferase Substrate，然后将其全部加入Firefly Luciferase Assay Buffer瓶中，充分混匀后按使用需求分装，并避光保存于-80℃。

注意：Firefly Luciferase Solution不能反复冻融，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格，-20℃避光保存，推荐3个月内使用，-80℃避光保存，12个月内有效。

实验步骤

1. 细胞裂解：

(1) 细胞：

a. 在合适的孔板上培养细胞后进行转染并用适当的方法处理细胞。

b. 将培养基移除，加PBS轻轻洗涤细胞2次（贴壁细胞进行此操作，悬浮细胞可直接离心收集细胞），吸弃PBS，按如下方案加入Lysis Buffer。

注意：Lysis Buffer使用前摇匀，如荧光素酶的表达水平较低，可适当减少Lysis Buffer用量，如24孔板每孔加入100 μL，6孔板每孔加入200 μL。

c. 细胞置于摇床上震荡5-10 min，充分裂解细胞。

d. 将细胞裂解产物10,000 rpm离心2 min，取上清用于检测。

(2) 原生质体（仅供参考）：

a. 制备原生质体，并将相应的质粒转化原生质体。

b. 16-24 h后离心收集2×10⁵原生质体，加入200 μL的Lysis Buffer。

c. 室温孵育5-10 min，充分裂解原生质体。

d. 将原生质体裂解产物10,000 rpm离心2 min，取上清用于检测。

(3) 植物叶片（仅供参考）：

a. 将含相应质粒的农杆菌注射植物叶片。

b. 注射后2天取约1 cm²的叶片加入500 μL裂解液，匀浆器研磨后10,000 rpm离心2 min，取上清用于检测。

注意：细胞裂解后可立即检测荧光素酶活性，也可以冻存，需要时再进行检测，冻存样品需融解至室温再进行检测。

2. 小心吸取20-100 µL细胞裂解上清（如果样品量足够，请加入100 µL，如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量应保持一致）至检测管或96孔全黑/全白酶标板中，将100 µL平衡至室温的Firefly Luciferase Solution加入检测管或酶标板中，迅速混匀后，立即于发光检测仪或多功能酶标仪中检测Firefly Luciferase报告基因活性。

注意事项

1. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行检测。

2. 为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，每个样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入Firefly Luciferase Solution。

3. 检测时需使用全黑色或白色的96孔板，防止相邻孔的干扰。

4. 萤火虫荧光素酶催化的生物发光的最强波长为560 nm。

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