CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒实验操作步骤

原理

5(6)-CFDA, SE是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞示踪染料，不仅可用于细胞增殖的体外实验，还可用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程。5(6)-CFDA, SE是二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）的衍生物，具有细胞膜渗透性，本身不具有荧光发光性。当通过被动运输穿透细胞膜进入活细胞后，被胞浆内的酯酶催化生成羧基荧光素琥珀酰亚胺（carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester，CFSE），可发强烈的绿色荧光，不能穿透细胞膜，能完好的保留在胞内。CFSE还可自发并不可逆地与细胞内的氨基结合从而偶联到细胞蛋白质上，同时过量且未被偶联的5(6)-CFDA, SE 通过被动扩散回到细胞外培养基内，被后续清洗步骤所清除。经 5(6)-CFDA, SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数月，因此非常适用于细胞群落分析。5(6)-CFDA, SE标记细胞的荧光非常均一，优于以前使用的其他细胞示踪荧光探针如PKH26，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也很均一。在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的一半，通过流式细胞仪（FL1通道）根据荧光强度的不同，可检测出未分裂细胞，分裂一次（1/2的荧光强度），二次（1/4的荧光强度），三次（1/8的荧光强度），以及更多分裂次数的细胞。5(6)-CFDA, SE可检测分裂次数多达八次甚至更多。经 5(6)-CFDA, SE标记的细胞可用于体外和体内增殖研究，且具有不会使邻近细胞染色的功能。 5(6)-CFDA, SE最常用于淋巴细胞的增殖检测，也可用于成纤维细胞，自然杀伤细胞，造血祖细胞等其他细胞的增殖检测。5(6)-CFDA, SE标记细胞呈绿色荧光，除了流式细胞仪检测细胞增殖外，还可用荧光酶标板定量活细胞数目，或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。

包装清单

自备耗材

·细胞培养板、可调节式移液枪及枪头

·离心机

·荧光显微镜或流式细胞仪

·PBS

试剂准备

CFDA SE Storage Solution：临用前配制，每管CFDA SE加入200 μL DMSO溶解制备CFDA SE Storage Solution，-20℃避光保存。CFDA SE Storage Solution宜尽快使用，最长保存时间不宜超过2个月。

Assay Buffer：用细胞培养级无菌水将Assay Buffer (10×)稀释10倍得到Assay Buffer，4℃保存。

Stain Solution：临用前配制，每1 mL Assay buffer加入1 μL的CFDA SE Storage Solution，混匀，使用前避光并预热至37℃。

实验步骤

A. 流式细胞术检测

1. 对于非贴壁细胞，300 g离心5 min收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶（不含 EDTA）消化细胞，然后300 g离心5 min离心收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。

注意：需准备悬浮在Assay Buffer的细胞样本，用于流式细胞检测时的阴性对照。

2. 用1 mL 37℃预热的Stain Solution重悬细胞1-5×10⁶细胞，37℃避光孵育10-30 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。

3. 孵育完成后，300 g离心5 min收集细胞。每个样品加入1 mL预热的完全培养基，轻轻重悬37℃孵育5-10 min，300 g离心5 min收集细胞。

4. 用PBS洗涤细胞两次，随后即可按照正常培养方法培养细胞或用流式细胞仪（FL1/BL1通道）直接检测。

B. 荧光显微镜检测

1. 对于贴壁细胞：

(1) 在合适的孔板上培养细胞，在CO₂细胞培养箱中37℃培养至少24 h，再进行后续实验。

(2) 用PBS清洗细胞2次。

(3) 加入适当体积37℃预热的Stain Solution到细胞中，通常96孔板每孔加入100 μL，24孔板每孔加入250 μL，12孔板每孔加入500 μL，6孔板每孔加入1 mL，37℃避光孵育10-30 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。

(4) 孵育结束后，更换成新鲜的37℃预热的培养液，37℃再避光孵育5-10 min。

(5) 用PBS清洗2-3次，即可在荧光显微镜下观察（CFDA SE为绿色荧光，Ex/Em=494/521 nm）。

2. 对于悬浮细胞：

(1) 参照步骤A.1-A.4的流式细胞染色，

(2) 将步骤 A.4的细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞，在荧光显微镜下观察。

注意事项

1. 使用前请将CFDA SE瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 本试剂盒对CFDA SE染色浓度做了优化处理，也可根据自身的细胞类型，培养条件以及应用方向来梯度摸索最佳的工作浓度及染色时间。

3. CFDA SE 易被水解，在水溶液中会很快变质，请在使用过程中避免接触水。在标记细胞的过程中和水接触是在许可的范围内的。

4. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓淬灭。

5. 若后续需要进行抗体标记，可进行固定和透化。

FAQ

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