葡萄糖含量检测试剂盒Pro实验解决方案

原理葡萄糖是几乎所有生物体的主要能量来源。血糖水平是许多代谢性疾病的关键诊断参数。葡萄糖的检测在研究和药物发现过程中都非常重要。CheKine™ Pro 葡萄糖含量检测试剂盒（荧光法）可检测动植物组织，细胞、血清（浆）、唾液、尿液、体液等生物样本。在该试剂盒中，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢，在过氧化物酶作用下，催化过氧化氢与无荧光物质反应生成有荧光的物质（Ex/Em=535/590 nm），与葡萄糖的量成正比。
自备耗材·荧光酶标仪(激发波长535 nm，发射波长590 nm)·96孔全黑板、可调节式移液枪及枪头·恒温箱、制冰机、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存6个月，避免反复冻融。注意：Reagent I有毒，建议在通风橱进行实验。Reagent II：即用型；-20℃避光保存。Reagent III：即用型；-20℃避光保存。Working Reagent：每孔准备50 µL工作液，现配现用。按照Assay Buffer：Reagent I：Reagent II：Reagent III=4,840 μL：50 μL：10 μL：100 μL的比例，混合均匀。Standard (400 nmol/mL)：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存6个月，避免反复冻融。标准品制备：4 nmol/mL标准品：10 µL Standard用990 µL Assay Buffer稀释；使用4 nmol/mL标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号		Standard体积（μL）		Assay Buffer体积（μL）		浓度（nmol/mL）
Std.1	12.5 μL 4 nmol/mL Standard		987.5		50
Std.2	500 μL of Std.1 (50 nmol/mL)		500		25
Std.3	500 μL of Std.2 (25 nmol/mL)		500		12.5
Std.4	500 μL of Std.3 (12.5 nmol/mL)		500		6.25
Std.5	500 μL of Std.4 (6.25 nmol/mL)		500		3.125
Std.6	500 μL of Std.5 (3.125 nmol/mL)		500		1.5625
Std.7	500 μL of Std.6 (1.5625 nmol/mL)		500		0.78125
Blank	0		500		0

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Assay Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2.细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3.血清（浆）等液体样本：10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。在进行检测前，请依据下表对样本进行稀释，稀释液为Assay Buffer（仅供参考）：

胡萝卜	100-300	兔肝脏	100-400
小鼠肌肉	5-20	HT29细胞	5-20
胎牛血清	100-300	Jurkat细胞培养液	50-200
唾液	1-3	尿液	2-5

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.荧光酶标仪预热30 min以上，调节激发波长到535 nm，发射波长到590 nm。2.操作表（下述操作在96孔全黑板中操作）：

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）
样本	0	0	50
Standard	0	50	0
Assay Buffer	50	0	0
Working Reagent	50	50	50

充分混匀，37℃反应15 min，记录各孔的荧光值RFU，荧光激发波长535 nm，荧光发射波长590 nm，空白孔记为RFU空白，标准孔记为RFU标准，测定孔记为RFU测定。计算ΔRFU测定=RFU测定-RFU空白，ΔRFU标准=RFU标准-RFU空白。注意：空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本稀释成不同浓度做预实验。根据预实验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.1-50 μM，选择合适的稀释倍数对样本进行检测。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔRFU标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU测定带入方程得到x (nmol/mL)。2.葡萄糖含量的计算：（1）按样本蛋白浓度计算葡萄糖(nmol/mg prot)=x÷Cpr×F（2）按样本鲜重计算：葡萄糖(nmol/g 鲜重)=x÷(W÷V样总)×F=x÷W×F（3）按照细胞数量计算葡萄糖(nmol/104 cell)=x÷(n÷V样总)×F=x÷n×F（4）按样本体积计算：葡萄糖(nmol/mL)=x×FV样总：加入Assay Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细胞数量，以万计；F：样本稀释倍数。注意事项1.ReagentⅠ具有光敏性，使用和保存需严格避光。2.如果Working Reagent出现红色，可先对Standard进行检测，若Blank孔荧光值大于Std.7 (0.78125 nmol/mL)，则Working Reagent失效，反之可以继续使用。3.每次检测都需要建立新的标准曲线。4.如果RFU测定较低或ΔRFU测定为负值，可适当减少样本稀释倍数或延长反应时间，但不得超过30 min。5.如果样本测不出值，建议取新鲜样本，重新检测。
结果展示以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。

Figure 1. (a)葡萄糖标准曲线。(b)本试剂盒测定胡萝卜和兔肝脏中葡萄糖的含量。(c)本试剂盒测定胎牛血清、Jurkat细胞培养液和尿液中葡萄糖的含量。
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