细胞衰老检测试剂盒（β-半乳糖苷酶法）实验操作步骤

原理

细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生物体衰老基本单位。细胞衰老在形态学上表现为细胞结构的退行性变，如核膜凹陷，最终导致核膜崩解，染色质结构变化，超二倍体和异常多倍体的细胞数目增加；细胞膜脆性增加选择性通透能力下降，膜受体种类、数目和对配体的敏感性等发生变化；脂褐素在细胞内堆积，多种细胞器和细胞内结构发生退行性变。细胞衰老在生理学上的表现为功能衰退与代谢低下，如细胞周期停滞，细胞复制能力丧失，对促有丝分裂刺激的反应性减弱，对促凋亡因素的反应性改变；细胞内酶活性中心被氧化，酶活性降低，蛋白质合成下降等。衰老细胞不再能够复制，但它们仍保持代谢活性，并且与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性呈阳性，这被认为是细胞衰老的生物标记。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时衰老相关β-半乳糖苷酶活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。以X-Gal为底物，在pH 6.0条件下，衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化会生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。本试剂盒适用于培养细胞和组织切片的衰老检测，但仅染色衰老细胞，不会染色衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞。

自备耗材

·显微镜

·无CO₂的37℃培养箱

·移液器及枪头、聚丙烯管(15 or 50 mL)

·制备试剂和缓冲溶液的各种玻璃器皿

·去离子水、甘油

·封口膜、6孔板

试剂准备

1×PBS：使用前，用去离子水稀释成1×PBS，平衡到室温；4℃保存。

1×Fixation Buffer：使用前，用1×PBS稀释成1×Fixation Buffer，平衡到室温；-20℃保存。

Reagent A：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Reagent B：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Reagent C：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

X-Gal solution：即用型；使用前，平衡到37℃；-20℃避光保存。将X-gal溶液在37℃加热1h是非常重要的，以避免聚集体的形成，因为其可能干扰染色细胞的可视化

Staining Working Solution：按10 µL Reagent A, 10 µL Reagent B,10 µL Reagent C ,50 µL X-gal solution和 920 µL 1×PBS的比例混匀试剂，再用NaOH或HCl调至pH 6.0。

注意：准备染色溶液时，请使用聚丙烯材料的容器或玻璃容器。可能会出现少量絮凝沉淀，摇动和混合后它将完全溶解。使用前确保完全溶解。

实验步骤

注意：Staining Working Solution对人体有毒和腐蚀性。处理时请小心，并注意有效的保护。避免与人体接触或直接吸入。

I 对于贴壁细胞：

1. 在6孔板的盖玻片上直接培养细胞，进行需要的处理。

2. 吸除细胞培养液，用1×PBS洗涤2次。

3. 每孔加入1 mL 1×Fixation Buffer，室温固定15 min。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。

4. 吸除细胞固定液，用1×PBS洗涤细胞3次。

5. 吸除1×PBS，每孔加入1 mL Staining Working Solution。

6. 在无CO₂的37℃培养箱中孵育过夜，直到细胞染上蓝色。

注意：用封口膜密封6孔板防止细胞干燥，并选择适当的染色时间。 由于细胞衰老染色与pH值相关，因此无法在含有CO₂的培养箱中培养细胞。

7. 将细胞置于光学显微镜下观察。计数蓝色细胞和总细胞的数目，并计算表达β-半乳糖苷酶的细胞（衰老细胞）的百分比。染色后，如不能及时观察计数，可以去除Staining Working Solution，加入2 mL1×PBS，4℃可以保存数天或用70%甘油溶液覆盖细胞在4℃下长期保存。

II 对于悬浮细胞：

1. 1,000 rpm，离心5 min收集细胞至1.5 mL离心管内，并用1×PBS洗涤2次。

2. 每管加入1 mL 1×Fixation Buffer，室温固定15 min。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。

3. 1,000 rpm，离心5 min后吸除细胞固定液,用1×PBS洗涤细胞3次。

4. 吸除1×PBS，每管加入1 mL Staining Working Solution。

5. 在无CO₂的37℃培养箱中孵育过夜，直到细胞染上蓝色。

6. 取部分染色后的细胞，滴加到载玻片上或6孔板内，普通光学显微镜下观察。计数蓝色细胞和总细胞的数目，并计算表达β-半乳糖苷酶的细胞（衰老细胞）的百分比。如不能及时观察计数，可以去除Staining Working Solution，加入2 mL1×PBS，4℃可以保存数天或用70%甘油溶液覆盖细胞在4℃下长期保存。

III 对于组织切片：

对于石蜡切片先按照常规方法进行脱蜡和水化处理。对于冷冻切片直接按照以下步骤进行。

1. 对于准备好的组织切片，加入适当体积的1×Fixation Buffer，以充分盖住组织为宜，室温固定15 min。

2. 用1×PBS浸泡洗涤组织3次。

3. 吸除1×PBS，加入适当量的Staining Working Solution。

4. 在无CO₂的37℃培养箱中孵育过夜，直到细胞染上蓝色。

5. 将组织切片置于光学显微镜下观察。计数蓝色细胞和总细胞的数目，并计算表达β-半乳糖苷酶的细胞（衰老细胞）的百分比。染色后，如不能及时观察，用70%甘油溶液覆盖组织切片在4℃下长期保存。

注意事项

1. 本试剂盒仅可染色衰老细胞，不会染色衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞。

2. X-Gal溶液在-20℃或4℃保存会冻结，室温或37℃水浴2-5 min并适当摇动即可完全融解。

3. 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH条件，不能在CO₂培养箱中进行染色反应。培养箱中较高浓度的CO₂会影响Staining Working Solution的pH值，而导致染色失败。对于多孔板，可以用封口膜或保鲜膜封住防止蒸发。

4. 试剂解冻后或使用前如果有沉淀，必须在使用前确保沉淀全部溶解。Reagent C刚从试剂盒中取出时，管底可能存在少量沉淀，属正常现象，充分混匀后，沉淀会全部溶解，并须确保在全部溶解后使用。配制Staining Working Solution时，也可能有少量絮状沉淀出现，震荡混匀后就会完全溶解，且须确保全部溶解后才能使用。

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