过氧化氢酶（CAT）Pro活性检测试剂盒实验解决方案
过氧化氢酶（CAT）Pro活性检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·荧光酶标仪（激发波长为535 nm，发射波长为587 nm）·全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头·低温离心机、恒温箱、制冰机·去离子水，PBS (pH 7.0)·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。H2O2 ReagentⅢ：临用前配制；取5 μL ReagentⅢ加入4.995 mL去离子水，混匀，取15 μL稀释后的ReagentⅢ，加入4.395 mL Assay Buffer，混匀，现用现配，按需配制，当天内使用。Working Reagent：临用前避光配制；取50 μL ReagentⅠ和20 μL ReagentⅡ，加入4.93 mL Assay Buffer，充分混匀，该体积可用100次，按需配制，当天内使用，使用时须避光。Standard (1 M)：使用前，用去离子水稀释10,000倍得到0.1 mM标准品，充分溶解待用。用不完的Standard (1 M) -20℃避光分装保存，避免反复冻融。注意：ReagentⅠ有毒，ReagentⅢ有腐蚀性，建议在通风橱进行实验。Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。
序号 | 0.1 mM标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（µM） |
Std.1 | 100 | 100 | 50 |
Std.2 | 80 | 120 | 40 |
Std.3 | 40 | 160 | 20 |
Std.4 | 20 | 180 | 10 |
Std.5 | 10 | 190 | 5 |
Std.6 | 5 | 195 | 2.5 |
Std.7 | 2.5 | 197.5 | 1.25 |
0（空白孔） | 0 | 200 | 0 |
样本制备注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存。1. 动植物组织：称取0.1 g样本，加入1 mL冷的Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2. 细胞：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL冷的Assay Buffer，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3. 血清或其他液体样本：10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。注意：1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本用Assay Buffer稀释成不同浓度进行预实验，根据预试验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.01-10 U/mL，请参考下表稀释（仅供参考）。
样本 | 稀释倍数 | 样本 | 稀释倍数 |
10%小鼠脑 | 30-60 | 10%小鼠肺 | 150-300 |
胎牛血清 | 2-10 | 293 cells | 4-10 |
人唾液 | 30-60 | L929细胞上清 | 不稀释 |
人尿液 | 30-50 | 10%烟草叶 | 2-6 |
实验步骤1. 荧光酶标仪预热到37℃，调节激发波长为535 nm，发射波长为587 nm。2. 操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：
试剂 | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） | 标准孔（μL） | ||||
样本 | 25 | 0 | 0 | ||||
Standard | 0 | 0 | 25 | ||||
去离子水 | 0 | 0 | 25 | ||||
H2O2 ReagentⅢ | 25 | 25 | 0 | ||||
酶标仪上振板10 s，37℃反应5 min | |||||||
Working Reagent | 50 | 50 | 50 | ||||
样本 | 0 | 25 | 0 | ||||
混匀，室温避光静置10 min，荧光酶标仪上设置激发波长535 nm，发射波长587 nm，测定各孔荧光值，分别记为RFU测定、RFU对照、RFU标准和RFU空白，计算ΔRFU测定=RFU对照-RFU测定，ΔRFU标准=RFU标准-RFU空白。 | |||||||
结果计算1.标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔRFU标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU测定带入方程得到x (μM)。2.CAT活性的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：37℃条件下，每mg蛋白每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。CAT(U/mg prot)=x×f÷5÷Cpr（2）按样本鲜重计算：酶活单位定义：37℃条件下，每g组织每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。CAT(U/g 鲜重)=x×f÷5÷W（3）按照细胞数量计算酶活单位定义：37℃条件下，每104个细胞每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。CAT(U/104 cell)=x×f÷5÷N（4）按液体体积计算：酶活单位定义：37℃条件下，每mL液体每分钟分解1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。CAT(U/mL)=x×f÷5Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；5：反应时间，5 min；f：样本稀释倍数；W：样品质量，g；N：细胞总数，万。
结果展示典型标准曲线：
Figure 1. CAT的标准曲线示例：1.取0.16 g小鼠脑加入1 mL Assay Buffer进行匀浆研磨，离心取上清稀释50倍之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：RFU测定为10,395，RFU对照为16,600，RFU空白为305，ΔRFU测定=16,600-10,395=6,205，标准曲线为y=568.3x+501.83，H2O2浓度为10.04 µM，CAT（样本）=10.04×50÷5÷0.16=627.5 U/g 鲜重。2.取胎牛血清离心取上清稀释5倍之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：RFU测定为6,380，RFU对照为13,390，RFU空白为305，ΔRFU测定=13,390-6,380=7010，标准曲线为y=568.3x+501.83，H2O2浓度为11.45 µM，CAT（样本）=11.45×5÷5=11.45 U/mL。
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