晚期氧化蛋白产物（AOPP）检测试剂盒实验解决方案
晚期氧化蛋白产物（AOPP）检测试剂盒实验解决方案
原理晚期氧化蛋白产物（AOPP）是新近发现的一类具有促炎活性的尿毒症毒素，是血浆蛋白遭受活性氧系（ROS）攻击后形成的氧化修饰产物。AOPP能激发单核细胞和中性粒细胞，刺激以肿瘤坏死因子TNF-ɑ为主的大量促炎性细胞因子的合成、释放，促进产生更多的活性氧，从而诱导和加重全身氧化应激和炎症状态。AOPP与晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End-Product, AGE）蛋白很相似，也发挥着相似生物功能。AOPP是肾并发症、动脉粥样硬化、糖尿病、代谢综合征、免疫性疾病和恶性肿瘤等疾病的重要检测指标。CheKine™ 晚期氧化蛋白产物（AOPP）检测试剂盒（微量法）可定量检测血浆、血清、动物组织和细胞等样本中AOPP的含量。样品或标准品与引发剂和终止液反应，产物在340 nm处有吸收峰，通过检测340 nm处OD值，通过与标准曲线比对，确定样品中AOPP的含量。
自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·制冰机、低温离心机、水浴锅·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer (1×)：临用前配制，用去离子水按1:9稀释至1×，混匀备用。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Standard：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：ReagentⅡ和Standard有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。Working AOPP-HSA Positive Control：临用前配制，用Extraction Buffer (1×)按1:19稀释，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。Working Free-HSA Negative Control：临用前配制，用Extraction Buffer (1×)按1:19稀释，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
序号 | 1,000 µmol/L标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（µmol/L） |
Std.1 | 100 | 900 | 100 |
Std.2 | 80 | 920 | 80 |
Std.3 | 60 | 940 | 60 |
Std.4 | 40 | 960 | 40 |
Std.5 | 20 | 980 | 20 |
Std.6 | 10 | 990 | 10 |
Std.7 | 5 | 995 | 5 |
Std.8 | 0 | 1,000 | 0 |
样本制备1. 细胞：收集细胞到离心管内，弃上清，按照每500万个细胞加入1 mL Extraction Buffer (1×)，超声波破碎细胞5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），13,000 g，4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。2. 动植物组织：称取约0.1 g组织，加入1 mL Extraction Buffer (1×)，进行冰浴匀浆，13,000 g，4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。3. 血清和血浆：用Extraction Buffer (1×)稀释5倍后直接检测。注意：如需用蛋白浓度计算，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。2. 96孔UV板或微量石英比色皿中按顺序加入下列试剂：
试剂 | 测定孔 （μL） | 空白孔 （μL） | 标准孔 （μL） | 阳性对照孔 （选做）（μL） | 阴性对照孔 （选做）（μL） | |
样本 | 200 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Extraction Buffer（1×） | 0 | 200 | 0 | 0 | 0 | |
Working AOPP-HSA Positive Control | 0 | 0 | 0 | 200 | 0 | |
Working Free-HSA Negative Control | 0 | 0 | 0 | 0 | 200 | |
Standard | 0 | 0 | 200 | 0 | 0 | |
ReagentⅠ | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
ReagentⅡ | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | |
混匀，37℃孵育5 min，记录340 nm处的吸光值，计算测定孔ΔA测=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白，阳性对照孔ΔA阳对=A阳对-A空白和阴性对照孔ΔA阴对=A阴对-A空白。 | ||||||
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1. 以各标准品浓度为y轴，ΔA标准为x轴，做标准曲线得到方程，将ΔA测带入方程，得到y (µmoL/L)。2. 样本中AOPP浓度计算(1) 按照蛋白浓度计算AOPP含量(µmol/g)=(y×V样)÷(V样×Cpr)×稀释倍数=y÷Cpr×n(2) 按照样本质量计算AOPP含量(µmol/g)=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)×稀释倍数=y÷W÷1,000×n(3) 按照血清和血浆计算AOPP含量(µmol/L)=y×n(4) 按照细胞密度计算AOPP含量(nmol/104 cells)=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)=y÷500V样：加入反应体系中样本体积，0.2 mL；V提取：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞总数，500万；n：样品稀释倍数。结果展示
Figure 2. 不同样品AOPP检测值
Figure 3. Free-HSA阴性对照组和AOPP-HSA阳性对照组在340 nm检测的OD值相关产品
Catalog No. | Product Name |
KTB1030 | CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活力检测试剂盒（微量法） |
KTB1040 | CheKine™ 过氧化氢酶（CAT）活性分析试剂盒（微量法） |
KTB1910 | CheKine™ 活性氧（ROS）检测试剂盒（荧光法） |
KTB1150 | CheKine™ 过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒（微量法） |
KTB1500 | CheKine™ 总抗氧化能力（TAC）检测试剂盒（微量法） |
