Caspase-3活性分析试剂盒（比色法）实验操作步骤

原理

半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已显示在凋亡中起关键作用。 哺乳动物Caspase可分为三个功能组：启动子半胱天冬酶（Caspase-2、8、9和10），执行者半胱天冬酶（Caspase-3、6和7）和炎性半胱天冬酶（Caspase-1、4、5、11 和 12）。Caspase-3（也称为Yama，CPP32和Apopain）在天冬氨酸残基的羧基末端切割其底物。 活性Caspase-3由两组同源二聚体（17和12 kDa）组成，它们均来自两个前体Caspase-3 多肽，并具有两个活性位点。Caspase-3与Caspases-8 和9一起位于细胞凋亡途径的关键连接点。Caspase-3活性分析试剂盒（比色法）基于Caspase -3水解肽底物 Ac-DEVD-pNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-对硝基苯胺），产生黄色的对硝基苯胺（pNA），pNA在405 nm附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测Caspase -3的活性。

自备耗材

·酶标仪（能测405 nm处的吸光度）

·96孔板

·低温离心机、制冰机

·可调节式移液枪及枪头

·去离子水、磷酸盐缓冲液 (PBS)

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Working Cell Lysis Buffer: 使用前，立即加入DTT（最终浓度：每1 mL Cell Lysis Buffer加10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。

Working Reaction Buffer (1×): 使用前，用去离子水稀释到Reaction Buffer (1×)，再加入DTT（最终浓度：每1 mL Reaction Buffer (1×)加10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。

Ac-DEVD-pNA (4 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

pNA (10 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

DTT (100×): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。

Standard设置：用Reaction Buffer (1×，含DTT)将标准品pNA (10 mM)稀释为200、100、50、20、10、0 µM的标准溶液。

样本制备

注意：我们建议使用新鲜样品。或按照“样本制备”将样品保存在-80℃。使用前，在冰上解冻，这可能会影响样品的稳定性，并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，它可能会干扰测定。

1. 通过所需方法诱导细胞凋亡。同时，建议对每个Caspase-3比色测定法设置不的对照培养。

2. 对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化收集细胞。600 g，4℃离心5 min，小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×10⁶个细胞。

3. 对于悬浮细胞，600 g，4℃离心5 min，小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×10⁶个细胞。

4. 对于组织，将5-20 mg组织切成小块，用PBS清洗组织，加入0.1 mL Working Cell Lysis Buffer，冰浴匀浆。

5. 裂解物冰上孵育15-20 min。

6. 16,000 g，4℃离心15 min，然后将上清液转移至新试管中，置冰上待测。

7. 立即测定Caspase-3的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪预热30 min以上，调节波长到405 nm。

2. 操作表（下述操作在96孔板中操作）：

3. 混匀，37℃孵育1-2 h，检测405 nm处吸光值。空白孔记为A_空，标准孔记为A_标、测定孔记为A_测。计算ΔA_测=A_测-A_空，ΔA_标=A_标-A_空。

注意：1.空白孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验；2.在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；3.发现颜色变化比较明显时即可测定405 nm的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 按标准曲线计算

以标准溶液浓度为x轴，ΔA_标为y轴，绘制标准曲线y=kx+b。将样本的ΔA_测带入方程得到x值（μM）。

2. 按酶活性增加百分比计算

Caspase-3活性增加百分比=(实验处理组A_测定-A_空白)/(实验对照组A_测定-A_空白)×100%

该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。

3. 按酶活计算

参考 Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37℃一个小时内可以剪切1 nmol pNA底物产生1 nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase酶活性。

Caspase-3活性(U/mg prot)=x×V_反总÷(V_样×Cpr)÷T×10³=2.1×x÷Cpr÷T

V_反总：反应体系总体积，0.105 mL=1.05×10^-4 L；V_样：加入的样本体积，0.05 mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10³：单位换算系数，1 μmol =10³ nmol。

注意：对于样品中Caspase-3酶活力特别高的情况，须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数n。

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