植物可溶性糖含量测定实验方案：蒽酮比色法（96孔板微量法）从提取到计算
本方案用于植物组织样本的可溶性糖测定，采用蒽酮比色法微量体系。样本用水提取，在 1.5 mL EP 管中完成显色反应，最后取 200 μL 转入 96 孔板，在 620 nm 下读数。
以下以 CheKine™ 植物可溶性糖含量检测试剂盒（微量法，货号 KTB1320）为例，按一次实验的实际顺序说明。
开始之前：准备材料
| 类别 | 内容 |
|---|---|
| 试剂盒自带 | 蒽酮（Anthrone，粉末）、Solvent（10 mL）、葡萄糖标准品（粉末，10 mg） |
| 自备试剂 | 去离子水、浓硫酸 |
| 自备仪器 | 能读 620 nm 的酶标仪、匀浆器（或研钵）、离心机、水浴锅或金属浴、制冰机 |
| 自备耗材 | 普通透明 96 孔板、有盖离心管（提取用）、10 mL 试管（定容用）、1.5 mL EP 管（反应用）、可调节式移液枪及枪头；样本多时建议准备多通道移液器 |
实验开始前先确认三件事：
酶标仪开机预热 30 min 以上，波长设为 620 nm。
确认通风橱可用。Solvent 有毒且有刺激性气味，浓硫酸腐蚀性强，配制试剂和加酸都应在通风橱中进行，全程穿戴实验服、口罩、手套和头套。
正式检测前，先选 2–3 个预期差异较大的样本做预实验，确认吸光度范围，再决定称样量和稀释倍数。
第一步：样本提取
建议使用新鲜样本。不能立即实验时，可在 -80℃ 保存 1 个月。
称取约 0.1 g 植物组织，加入 1 mL 去离子水，匀浆或研磨。
将匀浆转入有盖离心管，95℃ 水浴或金属浴 10 min。管盖要盖紧，避免水分散失，否则会改变提取液体积和浓度。
冷却后，8000 g、25℃ 离心 10 min。
取上清液转入 10 mL 试管，用去离子水定容至 10 mL，摇匀备用。
称样质量 W 要准确记录，后续计算会直接用到。
第二步：配制工作液和标准曲线
蒽酮工作液
向 Anthrone 中加入 3 mL Solvent，充分溶解后备用。较难溶解时，可加热搅拌。未用完的工作液可在 4℃ 保存 1 周。
葡萄糖标准溶液
临用前配制。
向 10 mg 葡萄糖标准品中加入 1 mL 去离子水溶解，得到 10 mg/mL 的标准溶液。未用完的部分可在 4℃ 保存 1 周。
标准曲线
以 10 mg/mL 标准溶液为起点，按下表逐级稀释：
| 序号 | 取用的标准溶液 | 去离子水（μL） | 浓度（mg/mL） |
|---|---|---|---|
| 1 | 50 μL 10 mg/mL | 950 | 0.5 |
| 2 | 80 μL 0.5 mg/mL | 120 | 0.2 |
| 3 | 100 μL 0.2 mg/mL | 100 | 0.1 |
| 4 | 100 μL 0.1 mg/mL | 100 | 0.05 |
| 5 | 100 μL 0.05 mg/mL | 100 | 0.025 |
| 6 | 100 μL 0.025 mg/mL | 100 | 0.0125 |
| 空白 | 0 | 200 | 0 |
稀释后的标准品不稳定，必须在 4 小时内用完，每次实验都重新制作标准曲线。
这里采用逐级稀释，前一级的误差会继续传到后一级。每一步都要更换枪头并充分混匀，同时尽量避免产生气泡。
第三步：加样与孵育
反应体系如下。各管总水相体积均为 100 μL，浓硫酸均为 200 μL。
| 试剂 | 空白管（μL） | 测定管（μL） | 标准管（μL） |
|---|---|---|---|
| 样本 | 0 | 40 | 0 |
| 标准溶液 | 0 | 0 | 40 |
| 去离子水 | 80 | 40 | 40 |
| 蒽酮工作液 | 20 | 20 | 20 |
| 浓硫酸 | 200 | 200 | 200 |
空白管只需 1 管；标准曲线每个浓度点各测 1 管。
按表中顺序加样，浓硫酸最后加入。加酸时沿管壁缓慢加入，不要悬空垂直滴入。直接滴入容易溅到管盖内壁，既有飞溅风险，溅出的液体也无法继续参与反应，会影响结果。加酸后立即盖紧并混匀。
例如，有 4 个处理组，每组 3 个生物学重复，每个样本做 2 个技术复管，共 24 管。再加 6 个标准浓度和 1 个空白，一批共 31 管。
一盒 96 T 的试剂盒各组分另有 10% 余量，足够完成 3 批这样的实验。由于每批实验都要重新做标准曲线，安排实验数量时要把这 7 管一起算进去。
孵育
所有管同时放入 95℃ 水浴或金属浴，孵育 10 min，并保持管盖盖紧。
加热时管内蒸汽压会上升，普通卡扣式管盖可能在中途崩开。管盖一旦打开，水分散失，体系浓度会发生变化，这一管的数据不能继续使用。
有条件时可使用能锁住管盖的离心管，或者使用带压条、卡扣的金属浴模块。没有这些条件时，可在孵育过程中查看一次；如果发现管盖已经崩开，该管直接作废并重做。
显色程度会随温度和时间变化，因此各管的孵育条件要保持一致。孵育结束后冷却至室温，再开盖取样。
第四步：读数与计算
读数
每管取 200 μL 转入 96 孔板，在 620 nm 下测定吸光度，分别记录为 A 测定、A 空白和 A 标准。
计算
先扣除空白：
ΔA 测定 = A 测定 − A 空白
ΔA 标准 = A 标准 − A 空白
以标准品浓度（mg/mL）为 y 轴、ΔA 标准为 x 轴绘制标准曲线。
将 ΔA 测定代入标准曲线方程，得到 y（mg/mL）。
换算样本中的可溶性糖含量：
按样本质量计算：
可溶性糖（mg/g）= 10 × y ÷ W × n
按样本蛋白浓度计算：
可溶性糖（mg/mg prot）= y ÷ Cpr × n
其中：
W 为称样质量（g），Cpr 为样本蛋白浓度（mg/mL），n 为稀释倍数。
公式中的 10 从哪里来
每个测定管加入的样本体积 V1 = 0.04 mL，其中含糖量为：
y × V1（mg）
这部分提取液对应的样本质量为：
W × V1 ÷ V2
其中 V2 = 10 mL，是提取液最终定容体积。
两者相除后，V1 抵消：
y × V2 ÷ W
由于 V2 = 10 mL，因此得到：
10 × y ÷ W
计算示例
取 0.1 g 水稻，按上述步骤操作。
A 测定 = 0.1495，A 空白 = 0.0555，因此：
ΔA 测定 = 0.1495 − 0.0555 = 0.094
代入典型标准曲线：
y = 0.3015x + 0.0026
得到：
y = 0.0309 mg/mL
因此：
可溶性糖 = 10 × 0.0309 ÷ 0.1 × 1 = 3.09 mg/g
这条典型标准曲线只用于示例。实际计算时，应使用当次实验重新制作的标准曲线。
官网还提供在线计算器：abbkine.cn → 技术中心 → 在线计算器，可输入实验数据计算结果。
如果需要按蛋白浓度归一化，可使用货号 KTD3001 的 BCA 蛋白质定量试剂盒测定 Cpr。
实验中最容易出问题的四个地方
1. ΔA 超出合适范围
如果 ΔA 测定低于 0.019，可适当增加样本量。
如果 ΔA 测定高于 1.6，可用去离子水稀释提取液后重新测定，最终结果乘以稀释倍数 n；也可以减少提取时的称样量。
稀释应在提取液这一步完成，反应管中的样本加样体积仍保持 40 μL 不变。
2. 标准曲线线性差
先检查逐级稀释过程：每一步是否更换枪头、是否充分混匀、是否产生气泡。
再检查标准品是否临用前配制，以及稀释后的标准品是否在 4 小时内用完。
3. 平行管之间差异大
依次检查：
称样和匀浆是否均匀；加酸和混匀节奏是否一致；所有管是否同时入浴、同时出浴；是否有管子在孵育过程中崩盖。
4. 读数偏高或背景异常
空白管扣除的是试剂本身的背景，不包含样本自身的颜色。
如果提取液带颜色或存在浑浊，这部分吸收也会被计入信号。先检查离心是否充分、取上清时是否带入沉淀，再确认蒽酮工作液是否已经放置超过 1 周。
如果完成上述排查后仍无法解决，可拨打亚科因技术支持电话 400-6800-830 咨询。
常见问题
样本可以冻存吗？
建议使用新鲜样本。不能立即实验时，可在 -80℃ 保存 1 个月。
没有酶标仪，能用分光光度计吗？
可以。此时需要按比例调整检测试剂的配制量，具体比例建议咨询技术支持。
标准曲线可以沿用上一次的吗？
不建议。稀释后的标准品不稳定，每次实验都应重新制作标准曲线，以提高结果的准确度。
延伸阅读
本文提及的产品仅供科研使用，不用于临床诊断。
