线粒体分离提取试剂盒(组织样品)-ExKine™

实验步骤

注意：所有的实验步骤需在 2-8℃进行。使用预冷的缓冲液和设备。确保所有的溶液是解冻和均匀的。对于骨骼肌组织使用 Lysis Buffer B(1×)，对于其它类型组织可以优先考虑使用 Lysis Buffer A(1×)。

I 软组织（肝脏或脑）

1. 准备新鲜的组织样本（动物死亡后一个小时内），并用冰冷的 PBS洗涤 2次；

注意：请勿冻结。

2. 将 100 mg组织切成很小的碎片，并用 1 mL冰冷的 Lysis Buffer A(1×)洗涤 1次。
3. 加入新鲜的 1 mL冰冷的 Lysis Buffer A(1×)，然后转移至预冷的匀浆器中。
4. 冰上匀浆样本，通常上下转动研磨 10-20 次。
5. 将匀浆转移至新管中，600 g离心 5 min。

注意：为了获得更高纯度的“较重的”线粒体部分，可将该步骤更改为 1,000 g离心 5 min。可以将 BSA（脱脂的，终浓度为 2 mg/mL）添加到 Lysis Buffer A(1×)中，以除去可能存在于组织中的脂质。

6. 将上清液收集在新管中，并在 4℃下，11,000 g离心 10 min。

注意：要获得更加纯化的线粒体，并减少 50%以上的溶酶体和过氧化物酶体污染物，可将该步骤更改为 3,000 g离心 15 min。上清液是细胞质部分。

7. 移除上清液，然后将沉淀重悬于 1 mL冰冷的 Lysis Buffer A(1×)中。重复步骤 5和 6。
8. 将沉淀（纯化的线粒体）悬浮在 Storage Buffer（每 100 mg组织 40 µL）。分装并冷冻存储在-80℃中直至使用。

注意：预计样品的蛋白质浓度应约为 10-25 mg/mL。

II 硬组织(骨骼肌)

1. 准备新鲜的组织样本（动物死亡后一个小时内），并用冰冷的 PBS洗涤 2次。

注意：请勿冻结。

2. 将 100 mg组织剪成很小的碎片，600 g离心 30 s，弃去上清液。
3. 用 1 mL 0.25 mg/mL胰蛋白酶悬浮样本在一个新的 2 mL微量离心管中。
4. 冰上孵育 5-10 min。

注意：孵育时间因不同组织而不同。

5. 在将组织离心几秒钟，然后移除上清液。
6. 用 1 mL冰冷的 Lysis Buffer B(1×)洗涤样品 1次，并在离心机中将组织旋转几秒钟。
7. 移除上清液，加入新鲜冰冷的 1 mL适当裂解液。
8. 将样本转移至预冷的匀浆器并于冰上匀浆样本（通常为 20-30次研磨）。
9. 将匀浆转移至新管中，600 g离心 10 min。

注意：为了获得更高纯度的“较重的”线粒体，可重复步骤 9。

10. 将上清液收集在新管中，并在 4℃下，11,000 g离心 10 min。

注意：要获得更加纯化的线粒体，并减少 50％以上的溶酶体和过氧化物酶体污染物，可将该步骤更改为 3,000 g离心 15 min。上清液是细胞质部分。

11. 移除上清液，用冰冷的 1 mL Lysis Buffer B(1×)重悬沉淀。重复步骤 9和 10。
12. 将沉淀（纯化的线粒体）悬浮在 Storage Buffer（每 100 mg组织 40 µL）。分装并冷冻存储在-80℃中直至使用。

注意：预计样品的蛋白质浓度应约为 10-25 mg/mL。