谷氨酰胺合成酶(GS)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 540 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机、恒温箱
• 去离子水
• 研钵或匀浆器

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前 37℃预热 20 min，充分混匀，如有沉淀，静置 10 min，取上清待用；-20℃保存。
• Reagent II：即用型；使用前 37℃预热 20 min，充分混匀，如有沉淀，静置 10 min，取上清待用；-20℃保存。
• Working Reagent III：临用前配制；取一瓶 Reagent III 加入 5 mL去离子水充分溶解待用，用不完的试剂-20℃分装避光可保存4周，避免反复冻融。
• Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 2,000万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 540 nm。可见分光光度计用去离子水调零。
2. 酶促反应（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：

充分混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴 30 min

混匀，25℃静置 10 min后，8,000 g，25℃离心 10 min，取 200 μL上清液至微量玻璃比色皿或 96孔板中，于 540 nm处测定吸光值，分别记为 A 测定、A 对照，计算ΔA=A 测定-A 对照。

结果计算

1. 按蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白在反应体系中每min使 540 nm下吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

2. 按样本鲜重计算：

定义：每 g组织在反应体系中每 min使 540 nm下吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

3. 按细胞或细菌数量计算

定义：每 10⁴个细菌或细胞在反应体系中每 min使 540 nm下吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

4. 按样本体积计算

定义：每 mL血清（浆）在反应体系中每 min使 540 nm下吸光值变化 0.005定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，0.4 mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.07 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30 min；W：样本鲜重，g；2,000：细菌或细胞总数，2,000万。