直链淀粉含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 620 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 烘箱、水浴锅、涡旋振荡仪、离心机
• 去离子水、无水乙醇、80%乙醇、乙醚
• 匀浆器

试剂准备

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent Ⅱ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent Ⅲ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Reagent Ⅳ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Standard：临用前配制；加入 0.1 mL无水乙醇和 0.9 mL Reagent Ⅳ，混匀后封口膜封口，沸水浴至溶解，即 10 mg/mL直链淀粉标准液；用不完的试剂 4℃保存 1个月。

1 mg/mL直链淀粉标准液：取 100 µL 10 mg/mL直链淀粉标准液加 900 µL ReagentⅠ配制成 1 mg/mL直链淀粉标准液；使用 1 mg/mL直链淀粉标准液，按照下表所示，进一步稀释标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

将样本置于 80℃烘箱烘干后，称取 0.01 g烘干样本于研钵中研碎，加入 1 mL 80%乙醇，充分匀浆后转移到 EP管中，80℃水浴提取 30 min，3,000 g，25℃离心 5 min，弃上清，留沉淀，加入 1 mL乙醚振荡 5 min后，3,000 g，25℃离心 5 min，弃上清，留沉淀，加入 1 mL ReagentⅠ充分溶解，90℃水浴 10 min，冷却后 3,000 g，25℃离心 5 min，取上清待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 620 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

混匀，测定 620 nm处吸光值，分别记为 A 测定，A 标准和 A 空白。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白孔和标准孔只需做 1-2次，若检测样本较多，可根据实验用量，按 Reagent Ⅱ：Reagent Ⅲ：去离子水=14: 2: 144的比例配成工作液，现用现配。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.05 mg/mL的ΔA 标准，可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.8 mg/mL的ΔA 标准，上清液可用 ReagentⅠ进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (mg/mL)。

2. 直链淀粉含量的计算：

按样本干重计算：

直链淀粉含量 (mg/g干重)=(x×V1)÷(W×V1÷V2)=x÷W×F

直链淀粉含量 (mg/g干重)=x÷W×F

V1：加入反应体系中样本体积，0.02 mL；V2：加入 ReagentⅠ体积，1 mL；W：样本质量，g；F：稀释倍数。