中性转化酶(NI)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 540 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机、制冰机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：Extraction Buffer和 Reagent III 有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 7 mL ReagentⅠ，96 T加入 14 mL ReagentⅠ，充分溶解。用不完的试剂 4℃保存 2周。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Standard：临用前配制；加入 1 mL去离子水，充分溶解得 10 mg/mL，用不完的试剂 4℃保存 1个月。使用 10 mg/mL Standard，按照下表所示，进一步稀释标准品：

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

1. 注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。由于 Extraction Buffer中含有一定浓度的蛋白（约 1 mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

混匀，37℃保温 30 min，置 95℃水浴中 10 min（盖紧，防止水分散失），流水冷却。

3. 混匀，95℃水浴 10 min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀，取 200 μL至 96孔板或微量石英比色皿中，记录 540 nm处吸光值 A。空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，对照孔记为 A 对照，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA小于 0.01，可适当增大样本量，如果ΔA大于 1.2，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (mg/mL)。

2. NI含量的计算：

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟产生 1 μg还原糖定义为一个酶活力单位。

NI (U/mg prot)=x×V 样÷(V 样×Cpr)÷T×1,000=33.3x÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：37℃每克样本每分钟产生 1 μg还原糖定义为一个酶活力单位。

NI (U/g 鲜重)=x×V 样÷(V 样×W÷V 样总)÷T×1,000=33.3x÷W

V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1,000：换算系数，1 mg/mL=1,000 µg/mL。

注意事项

如果加入 Reagent III，95℃水浴 10 min后有混浊物出现，建议 12,000 g，4℃离心 5 min后，取上清测定吸光度。