线粒体活性氧(ROS)产生速率检测试剂盒(荧光法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 可调节式移液枪及枪头
• 匀浆器、低温离心机、96 孔全黑酶标板或全白酶标板
• 恒温培养箱、多功能酶标仪

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。
• ReagentⅢ：临用前配制，96 T 加入 6 mL ReagentⅠ充分溶解，未用完的已溶解的 ReagentⅢ可 4℃避光保存 1 个月。
• ReagentⅣ：临用前配制，96 T 加入 6 mL ReagentⅠ充分溶解，未用完的已溶解的 ReagentⅣ可 4℃避光保存 1 个月。
• ReagentⅤ：临用前配制，96 T 加入 6 mL ReagentⅠ充分溶解，未用完的已溶解的 ReagentⅤ可 4℃避光保存 1 个月。
• Working ReagentⅥ：临用前配制，按照用量将 ReagentⅥ用 ReagentⅠ稀释 300 倍后使用，稀释好的 Working ReagentⅥ不可重复使用。

注意：ReagentⅥ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

样本制备

组织、细胞线粒体提取：

1. 称取约 0.1 g 组织或收集 500 万个细胞，加入 1 mL Extraction Buffer 和 10 µL ReagentⅡ，匀浆器冰浴匀浆，600 g，4℃离心 5 min，收集上清至新的离心管中，舍弃沉淀。
2. 再次离心上清，11,000 g，4℃离心 10 min，沉淀即为提取的线粒体。
3. 弃上清，沉淀加入 200 µL ReagentⅠ重悬，置于冰上待测。

注意：

1. (1) 建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。
2. (2) 提取好的线粒体样本需要在当天检测完，不可冷冻保存。
3. (3) 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3002 的蛋白质定量试剂盒（Bradford 法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 多功能酶标仪预热到 37℃，调节荧光激发波长 488 nm，发射波长 525 nm。
2. 在 96 孔全黑酶标板或全白酶标板按照如下方式加样：

3. 混匀，37℃避光孵育 15 min。孵育完成后，用多功能酶标仪测定 10 min 内的荧光值，激发波长 488 nm，发射波长 525 nm，仪器温度保持在 37℃，记录 10 min 内的荧光值变化。

注意事项

1. 需 37℃恒温下测定 10 min 内荧光强度变化。
2. 用移液器混匀时，要小心吸打，避免产生气泡。
3. 检测时需使用全黑色或白色的 96 孔板，防止相邻孔的干扰。

结果计算

1. 对采样数据点即荧光强度随时间的变化进行线性回归拟合处理,计算出回归系数，即直线斜率（k）。实际线粒体 ROS 产生速率等于样本荧光强度随时间变化（s）的数据点线性回归直线斜率(k 测定)减去本底荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率（k 空白），k=(RFU10min-RFU0min)/600。

2. 结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

(1) 按样本质量计算：每 g 组织线粒体每秒钟荧光单位的变化，即 u/s/g 鲜重。

(2) 按样本蛋白浓度计算：每 mg 蛋白线粒体每秒钟荧光单位的变化 u/s/mg prot。

(3) 按细胞数量计算:每 104个细胞每秒钟荧光单位的变化 u/s/104 Cells。

V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 总：重悬样本总体积，0.2 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，0.1 g；500: 细胞数量，5×106。