Na⁺/K⁺-ATP酶活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 660 nm 处的吸光度）
• 恒温箱
• 96 孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working ReagentⅠ：临用前加 7.2 mL 去离子水溶解；用不完的试剂-20℃避光分装保存 1 周，避免反复冻融。

ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working ReagentⅢ：临用前加 3 mL 去离子水溶解；用不完的试剂 4℃避光保存可稳定 2 周。

Working ReagentⅣ：临用前加 25 mL 去离子水溶解；用不完的试剂 4℃避光保存可稳定 2 周。

Working ReagentⅤ：临用前加 25 mL 去离子水溶解；用不完的试剂 4℃避光保存可稳定 2 周。

ReagentⅥ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

0.5 μmol/mL 标准磷应用液配制：将 Standard 以 20 倍稀释，即取 0.1 mL Standard 加 1.9 mL 去离子水充分混匀。

定磷剂的配制：按去离子水: Working ReagentⅣ: Working ReagentⅤ: ReagentⅥ=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现配现用。

样本制备

1. 血浆、血清等液体样本：可直接检测。

2. 动物组织样本：按 0.1 g 组织加入 1 mL 的 Extraction Buffer 的比例进行冰浴匀浆。匀浆液于 4℃，8,000 g 离心 10 min。取上清，置于冰上待测。

3. 细菌和细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，4℃，12,000 g 离心 1 min 弃上清；按照每 5×10⁶ 个细菌或细胞加入 1 mL Extraction Buffer，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30 次）；4℃，8,000 g 离心 10 min，取上清，置冰上待测。

4. 植物样本：用冷的 PBS 冲洗植物样本去除表面的杂质。按 0.1 g 组织加入 1 mL 的 Extraction Buffer 的比例进行冰浴匀浆。匀浆液于 4℃，8,000 g 离心 10 min。取上清，置于冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 660 nm，可见分光光度计用去离子水调零。

2. 酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）：

混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴锅准确反应 10 min

Working ReagentⅢ 25 25

样本 100 0

混匀，4,000 g，常温离心 10 min，取上清液

3. 定磷（96 孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂）

4. 混匀，室温放置 30 min，在 660 nm 处，记录各管吸光值。

结果计算

1. 血清（浆）等液体样本 Na+/K+-ATPase 活力的计算:

定义：规定每小时每毫升血清（浆）中 Na+/K+-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

2. 组织、细菌或细胞中 Na+/K+-ATPase 活力的计算：

(1) 按蛋白浓度计算：

定义：规定每小时每毫克组织蛋白中 Na+/K+-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算：

定义：规定每小时每克组织中 Na+/K+-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

(3) 按细菌或细胞密度计算：

定义：规定每小时每 1 万个细菌或细胞中 Na+/K+-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

C 标准：标准管浓度，0.5 μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.25 mL；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万个。