硫氧还蛋白还原酶(TrxR)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 412 nm处的吸光度）及水浴锅
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机，水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Chromogen：粉剂；使用前，Chromogen加入 3 mL去离子水溶解；用不完的试剂 4℃避光保存可稳定 2周。
• Working TrxR Cofactor：粉剂；使用前，TrxR Cofactor加入 5 mL去离子水溶解；用不完的试剂-20℃避光分装保存 2周，避免反复冻融。
• Inhibitor：即用型；使用前，避光平衡到室温；-20℃避光保存。

注意：Chromogen和 Inhibitor有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

样本制备

1. 动物组织：称取 0.1 g组织样本，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer，冰上匀浆。匀浆后的样本，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 血清（浆）：直接测定。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力。推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。细胞中 TrxR活性测定时，细胞数目须在 3-5×106之间，提取细胞中 TrxR时可加 Assay Buffer后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 412 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. Assay Buffer置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 30 min。
3. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

混匀，在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 30 min

4. 充分混匀，测定 412 nm处的吸光值，分别记录空白孔的 10 s为 A1；测定孔的 10 s为 A3，置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 5 min，记录空白孔的 5 min 10 s为 A2；测定孔的 5 min 10 s为 A4。计算ΔA 空=A2-A1，ΔA 测=A4-A3。

注意：(1) 空白孔只需做 1个即可。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，使得吸光值在 5 min内呈线性变化。测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）。(2) 哺乳动物组织及血液制品 TrxR活力测定时，一般须用去离子水稀释 5倍左右；测定过程操作须迅速。由于 Assay Buffer中含有一定浓度的蛋白（约 0.1 mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去 Assay Buffer本身的蛋白含量。(3) 如果ΔA 测小于 0.02可适当加大样本量。如果ΔA 测大于 1.0，样本可用 Assay Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔板测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1 μmol DTNB还原。

2. 按样本鲜重计算

活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1 μmol DTNB还原。

3. 按细胞或细菌数量计算

活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每 104个细胞或细菌每分钟催化 1 μmol DTNB 还原。

4. 按液体体积计算

活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1μmol DTNB 还原。

ΔA 空=A2-A1，ΔA 测=A4-A3；ε：TNB 在 412 nm处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μmol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200 μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106 μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）；W：样品质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20 μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），5 min；500：细胞或细菌数量，5×106。

B. 使用微量比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。