细胞衰老检测试剂盒(β-半乳糖苷酶法)

自备耗材

• 显微镜
• 无 CO2的 37℃培养箱
• 移液器及枪头
• 制备试剂和缓冲溶液的各种玻璃器皿
• 去离子水、甘油
• 封口膜、6孔板

试剂盒组分

试剂准备

1×PBS：使用前，用去离子水将 10×PBS稀释成 1×PBS，平衡到室温；4℃保存。

1×Fixation Buffer：使用前，用去离子水将 10×Fixation Buffer稀释成 1×Fixation Buffer，平衡到室温；-20℃保存。

Reagent A：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Reagent B：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Reagent C：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

X-Gal solution：即用型；使用前，平衡到 37℃；-20℃避光保存。将 X-gal溶液在 37℃加热 1h是非常重要的，以避免聚集体的形成，因为其可能干扰染色细胞的可视化

Staining Working Solution：按 10 µL Reagent A, 10 µL Reagent B,10 µL Reagent C, 50 µL X-gal solution和 920 µL 1×PBS的比例混匀试剂，再用 NaOH或 HCl调至 pH 6.0。

实验步骤

I 对于贴壁细胞：

1. 在 6孔板的盖玻片上直接培养细胞，进行需要的处理。
2. 吸除细胞培养液，用 1×PBS洗涤 2次。
3. 每孔加入 1 mL 1×Fixation Buffer，室温固定 15 min。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。
4. 吸除细胞固定液，用 1×PBS洗涤细胞 3次。
5. 吸除 1×PBS，每孔加入 1 mL Staining Working Solution。
6. 在无 CO2的 37℃培养箱中孵育过夜，直到细胞染上蓝色。
7. 注意：用封口膜密封 6孔板防止细胞干燥，并选择适当的染色时间。 由于细胞衰老染色与 pH值相关，因此无法在含有 CO2的培养箱中培养细胞。
8. 将细胞置于光学显微镜下观察。计数蓝色细胞和总细胞的数目，并计算表达β-半乳糖苷酶的细胞（衰老细胞）的百分比。染色后，如不能及时观察计数，可以去除 Staining Working Solution，加入 2 mL1×PBS，4℃可以保存数天或用 70%甘油溶液覆盖细胞在 4℃下长期保存。

II 对于悬浮细胞：

1. 1,000 rpm，离心 5 min收集细胞至 1.5 mL离心管内，并用 1×PBS洗涤 2次。
2. 每管加入 1 mL 1×Fixation Buffer，室温固定 15 min。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。
3. 1,000 rpm，离心 5 min后吸除细胞固定液,用 1×PBS洗涤细胞 3次。
4. 吸除 1×PBS，每管加入 1 mL Staining Working Solution。
5. 在无 CO2的 37℃培养箱中孵育过夜，直到细胞染上蓝色。
6. 取部分染色后的细胞，滴加到载玻片上或 6孔板内，普通光学显微镜下观察。计数蓝色细胞和总细胞的数目，并计算表达β-半乳糖苷酶的细胞（衰老细胞）的百分比。如不能及时观察计数，可以去除 Staining Working Solution，加入 2 mL1×PBS，4℃可以保存数天或用 70%甘油溶液覆盖细胞在 4℃下长期保存。

III 对于组织切片：

对于石蜡切片先按照常规方法进行脱蜡和水化处理。对于冷冻切片直接按照以下步骤进行。

1. 对于准备好的组织切片，加入适当体积的 1×Fixation Buffer，以充分盖住组织为宜，室温固定 15 min。
2. 用 1×PBS浸泡洗涤组织 3次。
3. 吸除 1×PBS，加入适当量的 Staining Working Solution。
4. 在无 CO2的 37℃培养箱中孵育过夜，直到细胞染上蓝色。
5. 将组织切片置于光学显微镜下观察。计数蓝色细胞和总细胞的数目，并计算表达β-半乳糖苷酶的细胞（衰老细胞）的百分比。染色后，如不能及时观察，用 70%甘油溶液覆盖组织切片在 4℃下长期保存。

注意事项

1. 本试剂盒仅可染色衰老细胞，不会染色衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞。
2. X-Gal溶液在-20℃或 4℃保存会冻结，室温或 37℃水浴 2-5 min并适当摇动即可完全融解。
3. 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的 pH条件，不能在 CO2培养箱中进行染色反应。培养箱中较高浓度的 CO2会影响Staining Working Solution的 pH值，而导致染色失败。对于多孔板，可以用封口膜或保鲜膜封住防止蒸发。
4. 试剂解冻后或使用前如果有沉淀，必须在使用前确保沉淀全部溶解。Reagent C刚从试剂盒中取出时，管底可能存在少量沉淀，属正常现象，充分混匀后，沉淀会全部溶解，并须确保在全部溶解后使用。配制 Staining Working Solution时，也可能有少量絮状沉淀出现，震荡混匀后就会完全溶解，且须确保全部溶解后才能使用。