淀粉分支酶(SBE)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 660 nm 处的吸光度）
• 96 孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、水浴锅、制冰机、恒温箱
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂盒组分

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Substrate：临用前 96 T 加入 6 mL 去离子水，48 T 加入 3 mL 去离子水，上下颠倒摇晃几次，加热至溶解。溶解后的 Substrate 4℃保存两周，若有沉淀析出，可 70℃加热溶解后使用。

Chromogen：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

样本制备

1. 植物组织：称取约 0.1 g 组织加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴中匀浆。15, 000 g，4℃离心 15 min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌：收集 500 万细菌到离心管内，用冷 PBS 清洗细菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），15, 000 g，4℃离心 15 min，取上清，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 660 nm；可见分光光度计用去离子水调零。恒温箱预热到 37℃。
2. 样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

混匀，37℃准确保温 20 min，置沸水浴中 5 min 终止反应（盖紧防止水分散失），冷却至室温

3. 混匀，室温静置 5 min，取 200 μL 至 96 孔板或微量玻璃比色皿中，660 nm 处读取各管吸光值，分别记为 A 对照，A 测定，计算 ΔA=A 对照-A 测定。

结果计算

A. 使用 96 孔板测定的计算公式

1. 按照样本质量计算

单位的定义：以波长 660 nm 的吸光度下降百分率表示，每 g 组织在反应体系中每分钟降低 0.5%碘蓝值为一个酶活性单位。

2. 按照蛋白浓度计算

单位的定义：以波长 660 nm 的吸光度下降百分率表示，每 mg 蛋白在反应体系中每分钟降低 0.5%碘蓝值为一个酶活性单位。

3. 按细菌数量计算

单位的定义：以波长 660 nm 的吸光度下降百分率表示，每 10⁴个细菌在反应体系中每分钟降低 0.5%碘蓝值为一个酶活性单位。

B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

1. 按照样本质量计算

单位的定义：以波长 660 nm 的吸光度下降百分率表示，每 g 组织在反应体系中每分钟降低 1%碘蓝值为一个酶活性单位。

2. 按照蛋白浓度计算

单位的定义：以波长 660 nm 的吸光度下降百分率表示，每 mg 蛋白在反应体系中每分钟降低 1%碘蓝值为一个酶活性单位。

3. 按细菌细胞数量计算

单位的定义：以波长 660 nm 的吸光度下降百分率表示，每 10⁴个细菌在反应体系中每分钟降低 1%碘蓝值为一个酶活性单位。

V_反总：反应体系体积，0.3 mL；W：样本质量，g；V_提取：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；V_样：加入样本体积，0.065 mL；T：反应时间，20 min；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；500：细菌总数，500 万。