β-淀粉酶活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 540 nm 处的吸光度）
• 96 孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、水浴锅、制冰机、恒温箱
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

DNS Reagent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

注意：DNS Reagent 有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Substrate：临用前 96 T 加入 42 mL 去离子水，48 T 加入 21 mL 去离子水，上下颠倒摇晃几次，95℃加热至溶解。溶解后的 Substrate 4℃保存一周，若有沉淀析出，可 95℃加热溶解后使用。

Standard：含 10 mg 无水葡萄糖，临用前加入 1 mL 去离子水溶解得 10 mg/mL 标准品。溶解后的标准品可 4℃保存 2 周。

标准曲线设置

按下表所示，用去离子水将 10 mg/mL 标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mg/mL 的标准溶液。

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4 小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本。

1. 动物组织

称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL 去离子水匀浆，将匀浆倒入离心管中，在室温下放置 15 min，每隔 5 min 振荡 1 次，使其充分提取。6,000 g，室温离心 10 min，吸取上清液并且加去离子水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液 1 mL，加入 4 mL 去离子水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α＋β)淀粉酶总活力的测定。

2. 植物组织

称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL 去离子水捣碎，超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），在室温下放置 15 min，每隔 5 min 振荡 1 次，使其充分提取。6,000 g，室温离心 10 min，吸取上清液并且加去离子水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液 1 mL，加入 4 mL 去离子水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α＋β)淀粉酶总活力的测定。

3. 血清（浆）和唾液等液体样本

直接测定，建议预实验确定合适的稀释倍数，适当稀释的液体样本即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液 1 mL，加入 4 mL 去离子水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α＋β)淀粉酶总活力的测定。

注意：对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 540 nm，可见分光光度计用去离子水调零；水浴锅预热到 70℃。
2. 每个样本取 2 支 EP 管分别加入 75 μL 淀粉酶原液和淀粉酶稀释液，沸水浴 5 min，分别作为 α-淀粉酶对照管和总淀粉酶对照管使用。
3. 样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

70℃水浴 15 min，冷却

40℃恒温水浴中保温 5 min

混匀，沸水浴 5 min，冷却，取 200 μL 至 96 孔板或微量玻璃比色皿中，测定 540 nm 处的吸光值，计算 ΔAα=A 测定α-A 对照α；ΔA 总=A 测定总-A 对照总；ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：每个样本需分别设置 α-淀粉酶活力测定对照和总淀粉酶活力测定对照，空白管只需做 1 管。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本 A 测定大于 2，则说明样本酶活力太高，必须用去离子水稀释成适当浓度（计算公式中乘以相应稀释倍数）。若样本 ΔA 测定小于 0.005 可以重新提取样本减少去离子水定容的体积。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为 y 轴，ΔA 标准为 x 轴，绘制标准曲线。将 ΔAα带入方程得到 y1值（mg/mL），ΔA 总带入方程得到 y2值（mg/mL）。

2. α-淀粉酶活性计算

(1) 按样本质量计算

单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g 质量)=y1×V 样÷(W×V 样÷V 样总)÷T×n=2×y1÷W×n

(2) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)=y1×V 样÷(Cpr×V 样)÷T×n=0.2×y1÷Cpr×n

(3) 按液体样本体积计算

单位的定义：每 L 液体样本每分钟产生 1 mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/L)=1,000×y1÷T×n=200×y1×n

3. 总淀粉酶活性计算

(1) 按照样本质量计算

单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/g 质量)=5×y2×V 样÷(W×V 样÷V 样总)÷T×n=10×y2÷W×n

(2) 按照蛋白质含量计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×y2×V 样÷(V 样×Cpr)÷T×n=y2÷Cpr×n

(3) 按液体样本体积计算

单位的定义：每 L 液体样本每分钟产生 1 mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/L)=5×1,000×y2÷T×n=1,000×y2×n

4. β-淀粉酶活性计算

(1) 按照样本质量计算

单位定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1 mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/g 质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(10×y2÷W×n)-(2×y1÷W×n)=(10×y2-2×y1)÷W×n

(2) 按照蛋白质含量计算

单位定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1 mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(y2÷Cpr×n)-(0.2×y1÷Cpr×n)=(y2-0.2×y1)÷Cpr×n

(3) 按液体样本体积计算

单位的定义：每 L 液体样本每分钟产生 1 mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/L)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(1,000×y2×n)-(200×y1×n)=(1,000×y2-200×y1)×n

V 样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；W：样本质量，g；V 样总：样本总体积，10 mL；T：反应时间，5 min；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；1,000：1 L=1,000 mL；5：总淀粉酶稀释倍数。