α-淀粉酶活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 540 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
• 离心机，水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

DNS Reagent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

注意：DNS Reagent有毒，建议在通风橱进行实验。

Substrate：临用前加入 20 mL去离子水，上下颠倒摇晃几次，加热至溶解；用不完的试剂 4℃保存 1周；如有沉淀，可加热至 70℃溶解。

Standard：临用前加入 1 mL去离子水溶解得 10 mg/mL标准品（葡萄糖）。4℃可保存 2周。

标准曲线设置

按下表所示，用去离子水将 10 mg/mL标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mg/mL的标准溶液。

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本。

1. 动物组织

称取约 0.1 g样本，加入 1 mL去离子水匀浆，匀浆液倒入离心管中，在室温下放置 15 min，每隔 5 min振荡 1次，使其充分提取。6,000 g，室温离心 10 min，吸取上清液并且加去离子水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。

2. 植物组织

称取约 0.1 g样本，加入 1 mL去离子水捣碎，超声波破碎 5 min（功率 20%，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），在室温下放置 15 min，每隔 5 min振荡 1次，使其充分提取。6,000 g，室温离心 10 min，吸取上清液并且加去离子水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。

3. 血清（浆）和唾液等液体样本

直接测定。建议预实验确定合适的稀释倍数。

注意：对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 540 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 水浴锅预热到 70℃。
3. 取 75 μL样本沸水浴 5 min作为对照管使用。
4. 样本测定（在 EP管中依次加入下列试剂）：

70℃水浴 15 min，冷却

40℃恒温水浴中保温 5 min

5. 混匀，沸水浴 5 min，冷却，取 200 μL至 96孔板或微量玻璃比色皿中，测定 540 nm处的吸光值，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照；ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：每个样本需设置一个对照管，空白管只需做 1管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本 A 测定大于2，则说明样本酶活力太高，必须用去离子水稀释成适当浓度（计算公式中乘以相应稀释倍数）。若ΔA 测定小于 0.005可以重新提取样本减少去离子水定容的体积。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为 y轴，ΔA 标准为 x轴，绘制标准曲线。将ΔA 测定带入方程得到 y值（mg/mL）。

2. α-淀粉酶活性计算

(1) 按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化产生 1 mg还原糖定义为 1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g 质量)=y×V 样÷(W×V 样÷V 样总)÷T×n=2×y÷W×n

(2) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟产生 1 mg还原糖定义为 1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)=y×V 样÷(Cpr×V 样)÷T×n=0.2×y÷Cpr×n

(3) 按液体样本体积计算

单位的定义：每升液体样本每分钟产生 1 mg还原糖定义为 1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/L)=1,000×y÷T×n=200×y×n

V 样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；W：样本质量，g；V 样总：样本总体积，10 mL；T：反应时间，5 min；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；1,000: 1 L=1,000 mL