果糖-1,6-二磷酸酯酶(FBP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机、制冰机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ReagentⅠ：临用前配制；48 T加入 10 mL Reagent IV，96 T加入 20 mL Reagent IV，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent II：临用前配制；48 T加入 0.6 mL去离子水，96 T加入 1.2 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent III：临用前配制；取一管加入 1.2 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

样本制备

1.组织：

称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

2.细胞：

收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ、II、III 置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 10 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中依次操作）：

4. 充分混匀，记录 340 nm处 10 s时吸光值 A1，37℃反应 5 min记录 310 s时的吸光值 A2。测定孔记为 A 测定，空白孔记为 A 空白。计算ΔA=(A2 测定-A1 测定)-(A2 空白-A1 空白)。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

FBP活性的计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟生成 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

(3) 按细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴细胞每分钟生成 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L /mol /cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细胞数量，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。