果糖-1,6-二磷酸(FDP)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 540 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent II：临用前配制；48 T加入 0.28 mL去离子水，96 T加入 0.56 mL去离子水，充分溶解待用。4℃避光保存可稳定 1个月。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：Reagent III 有毒，建议在通风橱进行实验。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Standard：临用前配制；加入 1 mL去离子水充分溶解，配制成 1 mg/mL果糖-1，6-二磷酸标准品；4℃避光保存可稳定 1个月。

标准品制备

使用 1 mg/mL果糖-1,6-二磷酸标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

充分混匀，37℃反应 30 min

充分混匀，37℃反应 10 min

3. 充分混匀，37℃反应 10 min，记录 540 nm处吸光值，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.02可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.5，样本可用 ReagentⅠ进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (µg/mL)。
2. FDP含量的计算：

• （1）按样本鲜重计算：
  FDP(µg/g 鲜重)=x÷(W÷V 样总)=x÷W
• （2）按照细胞数量计算
  FDP(µg/104 cell)=x÷(n÷V 样总)=x÷n
• （3）按样本体积计算：
  FDP(µg/mL)=x÷V 样总=x

V 样总：加入 ReagentⅠ体积，1 mL；W：样本重量，g；n：细胞数量，以万计