二胺氧化酶(DAO)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 460 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机，制冰机，恒温箱
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

试剂盒组分

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Working ReagentⅠ：临用前配制；根据用量将 Extraction Buffer和 ReagentⅠ按照 108:2的比例配制；现用现配。

Working ReagentⅡ：临用前配制；48 T加入 2.4 mL去离子水充分溶解，96 T加入 4.8 mL去离子水充分溶解，未用完的已溶解的Working ReagentⅡ可 4℃保存一周。

Working ReagentⅢ：临用前配制；48 T加入 1.2 mL去离子水，96 T加入 2.4 mL去离子水 37℃水浴充分溶解，未用完的已溶解的Working ReagentⅢ分装后-20℃避光保存一周，避免反复冻融。Working ReagentⅢ有少许沉淀是正常现象，如对结果有影响请过滤。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）、细胞上清、尿液等液体样本：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 460 nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 恒温箱预热到 37℃。
3. 样本测定（在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：

混匀，37℃孵育 5 min，测定 460 nm吸光值。对照孔记为 A 对照，测定孔记为 A 测定，计算ΔA=A 测定-A 对照。

结果计算

A. 使用 96孔板测定的计算公式

1. 动植物组织 DAO活力的计算

(1) 按蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1 μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟催化产生 1 μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。

2. 液体样本 DAO活力的计算

单位的定义：每 mL液体样本在反应体系中每分钟催化产生 1 μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。

3. 按细胞或细菌数量计算

单位的定义：每 104个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化产生 1 μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活力单位。

ΔA=A 测定-A 对照；d：96孔板的光径，0.5 cm；ε：氧化型邻联茴香胺消光系数，7.5×10^-3mL/μmol/cm；V 反总：反应总体积，0.2 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V 样本：加入样本体积，0.05 mL；T：反应时间，5 min；n：稀释倍数；W：样本鲜重，g；V 提取，加入 Extraction Buffer体积，1 mL；500：细胞或细菌总数，500万。

B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。