葡萄糖激酶(GCK)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备仪器与试剂

注意事项

• ⚫ 正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。
• ⚫ 对于组织样本及细胞样本等，可通过测定蛋白浓度来进行样本间结果均一化。推荐使用亚科因货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）。
• ⚫ 本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。如有疑问，可咨询本司技术人员（400-6800-830）。
• ⚫ 建议实验者自行建立标准曲线以提高结果准确度。如未自行建立标准曲线，可参考结果展示部分的典型标准曲线公式进行结果计算。
• ⚫ 生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。
• ⚫ 本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

实验流程

试剂准备

试剂准备

*请在实验前检查各组分的量。

*各组分在规格基础上额外提供 10%的量用于进行标准曲线制作或预实验。

标准品配制

使用去离子水将浓度为 2000 μM 的标准品稀释为 1000 μM、500 μM、250 μM、125 μM、62.5 μM、31.25 μM、15.625 μM 的标准溶液。每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4 小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1 个月。

• ⚫ 动植物组织样本：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL 提取液，冰浴匀浆，8000 g，4℃离心 10 min，取上清液置冰上待测。
• ⚫ 细胞（菌）：收集 5×10⁶个细胞或细菌到离心管内，用预冷的 PBS 清洗，离心后弃上清。加入 1 mL 提取液，冰浴超声破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 8000 g，4℃离心 10 min，取上清液置冰上待测。
• ⚫ 血清（浆）和其他液体样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪准备：预热 30 min 以上，调节波长到 450 nm。
2. 测定工作液的配制：每孔需要 190 μL 工作液，为避免损失，按 193.5 µL 每单孔体系配制：吸取试剂二工作液 92 µL、试剂三工作液 92 µL、试剂四工作液 3.5 µL、试剂五 5 µL、试剂六 1 µL，混合均匀。测定工作液需现配现用。
3. 对照工作液的配制：每孔需要 190 μL 工作液，为避免损失，按 193.5 µL 每单孔体系配制：吸取试剂一 91 µL、试剂二工作液 92 µL、试剂三工作液 1 µL、试剂四工作液 3.5 µL、试剂五 5 µL、试剂六 1 µL，混合均匀。对照工作液需现配现用。
4. 检测体系配制：在 96 孔板中按照如下方式操作，空白孔和标准孔只需做 1-2 次。

5. 反应体系充分混匀后在室温孵育 5 min。
6. 吸光度检测：在 450nm 处读取吸光度值，分别标记为 A 空白、A 标准、A 测定和 A 对照。

结果计算

自动计算

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手动计算

以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。

1. 数据处理
   计算 ΔA 标准=A 标准-A 空白, ΔA 测定=A 测定-A 对照。
2. 标准曲线绘制
   以标准品浓度为 y 轴，ΔA 标准为 x 轴，绘制标准曲线。将 ΔA 测定代入方程得到 y 值（μM）。
3. 样本 GCK 活性计算

• ⚫ 按样本质量计算
  单位的定义：每 g 组织每分钟催化底物产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
  GCK(U/g)=y×V 标准÷V 样×V 提取÷W÷T×n=0.2×y÷W×n
• ⚫ 按细胞或细菌数量计算
  单位的定义：每 10⁴个细胞或细菌每分钟催化底物产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
  GCK(U/10⁴)=y×V 标准÷V 样×V 提取÷500÷T×n=0.0004×y×n
• ⚫ 按液体体积计算
  单位的定义：每毫升液体每分钟催化底物产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
  GCK(U/mL)=y×V 标准÷V 样÷T×n=0.2×y×n
• ⚫ 按蛋白浓度数量计算
  单位的定义：每 mg 蛋白每分钟催化底物产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
  GCK(U/mg prot)=y×V 标准÷V 样÷Cpr÷T×n=0.2×y÷Cpr×n

nmol：1 μM=1 nmol/mL；V 标准：加入标准品体积，10 μL；V 样：加入样本体积，10 μL；V 提取：加入提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5 min；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌数量，5×10⁶，以 10⁴为单位。