甲基柠檬酸合酶(MCS)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 412 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水、无水乙醇
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

注意：Reagent III 有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Working Reagent V：临用前配制；48 T加入0.6 mL无水乙醇和13.2 mL Reagent IV，96 T加入1.2 mL无水乙醇和26.4 mL Reagent IV，充分溶解待用。用不完的试剂分装后-20℃避光保存 1个月，禁止反复冻融。

Working Reagent VI：临用前配制；48 T加入 1.5 mL去离子水，96 T加入 3 mL去离子水，充分溶解待用。用不完的试剂分装后-20℃避光保存 1个月，禁止反复冻融。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

组织或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：称取约 0.1 g样本或收集 500万细胞，加入 1 mL ReagentⅠ和 10 μL Reagent III，用匀浆器或研钵冰浴匀浆。将匀浆 600 g，4℃离心 5 min，弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11,000 g，4℃离心 10 min，上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的MCS（可选做）。沉淀即为线粒体，加入200 μL Reagent II和2 μL Reagent III，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30次），用于线粒体 MCS测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 412 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 将Working Reagent V 在 37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）预热 10 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

4. 混匀，立即记录 412 nm处初始吸光值 A1和 20 min后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果 A大于 1.5或ΔA大于 1，样本可用 ReagentⅠ或 Reagent II 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

MCS活性的计算：

(1) 按样本鲜重计算：

单位的定义：每克组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活性单位。

MCS 上清(U /g 鲜重)=92.83×ΔA 上清÷W

MCS 沉淀(U /g 鲜重)=18.57×ΔA 沉淀÷W

总 MCS(U /g 鲜重)=MCS 上清+MCS 沉淀=92.83×ΔA 上清÷W+18.57×ΔA 沉淀÷W

(2) 按细胞密度计算：

单位的定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活性单位。

MCS 上清(U /104 cell)=92.83×ΔA 上清÷n

MCS 沉淀(U /104 cell)=18.57×ΔA 沉淀÷n

总 MCS(U /104 cell)=MCS 上清+MCS 沉淀=92.83×ΔA 上清÷n+18.57×ΔA 沉淀÷n

ΔA 上清：上清测定值；ΔA 沉淀：沉淀测定值；V 反总：反应体系总体积，2.5×10^-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 提取：加入 Reagent Ⅰ和Ⅲ的体积，1.01 mL；V 样总：加入 Reagent II 和Ⅲ的体积，0.202 mL；T：反应时间，20 min；W：样本质量，g；n：细胞总数，万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2. 尽量用新鲜样本提取 MCS，以保证酶的活力。