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活动截止时间：2024年1月31日
亚科因生物研发的Caspase-8 活性分析试剂盒（比色法）（Caspase-8 Assay Kit, Colorimetric）是一款专为细胞凋亡早期/中期检测设计的核心试剂盒，通过比色法对细胞裂解液中Caspase-8的活性进行定量分析，帮助研究者快速评估细胞凋亡状态。
Caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一类在细胞凋亡与周期调控中起关键作用的蛋白酶家族。在人类已鉴定的11种Caspase中，Caspase-8隶属于Caspase-3亚族，是细胞凋亡信号通路中的上游启动者。当细胞受到凋亡刺激时，Caspase-8被激活并剪切下游底物，触发凋亡级联反应。本试剂盒以特异性底物Ac-IETD-pNA为核心，Caspase-8可将其剪切生成黄色的对硝基苯胺（pNA），产物在405 nm处具有特征吸收峰，其吸光度值与酶活性成正比，从而实现对凋亡进程的灵敏监测。
该试剂盒广泛应用于肿瘤细胞凋亡模型构建、抗癌药物疗效评估、神经退行性疾病机制研究以及免疫调节相关的基础科研场景。
| 中文名称 | Caspase-8 活性分析试剂盒(比色法) |
| 英文名称 | Caspase-8 Assay Kit (Colorimetric) |
| 产品货号 | KTA3025 |
| 检测类型 | 比色法 |
| 试剂盒组分 | • Cell 裂解缓冲液 • 反应缓冲液 (2×) • Ac-IETD-pNA (4mM) • pNA(10mM) • DTT (100×) |
| 保存建议 | 请参阅说明书中各个组件的存储条件，自发货之日起，按照推荐的保存条件，有效期为12个月。 |
| 运输条件 | 冰袋运输（蓝冰） |
| 警告 | 本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。 |
Working Cell Lysis Buffer: 使用前，立即加入 DTT（最终浓度：每 1 mL Cell Lysis Buffer加 10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。
Working Reaction Buffer (1×): 使用前，用去离子水稀释到 Reaction Buffer (1×)，再加入 DTT（最终浓度：每 1 mL Reaction Buffer (1×)加 10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。
Ac-IETD-pNA (4 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
pNA (10 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
DTT (100×): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。
| 序号 | 标准品体积 | Reaction Buffer (1×，含 DTT) (µL) | 标准品浓度（μM） |
|---|---|---|---|
| Std.1 | 6 µL pNA (10 mM) | 294 | 200 |
| Std.2 | 150 µL of Std.1 (200 μmol/mL) | 150 | 100 |
| Std.3 | 150 µL of Std.2 (100 μmol/mL) | 150 | 50 |
| Std.4 | 150 µL of Std.3 (50 μmol/mL) | 150 | 25 |
| Std.5 | 150 µL of Std.4 (25 μmol/mL) | 150 | 12.5 |
| Std.6 | 0 | 150 | 0 |
注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。
注意：我们建议使用新鲜样品。或按照"样本制备"将样品保存在-80℃。使用前，在冰上解冻，这可能会影响样品的稳定性，并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，它可能会干扰测定。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。
1. 酶标仪预热 30 min以上，调节波长到 405 nm。
2. 操作表（下述操作在 96孔板中操作）：
| 空白孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） | 标准孔（μL） | |
|---|---|---|---|---|
| Working Reaction Buffer (1×，含 DTT) | 100 | 50 | 55 | 0 |
| Standard | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 上清 | 0 | 50 | 50 | 0 |
| Ac-IETD-pNA (4mM) | 5 | 5 | 0 | 0 |
混匀，37℃孵育 1-2 h，检测 405 nm处吸光值。空白孔记为 A 空，测定孔记为 A 测，对照孔记为 A 对。计算ΔA 测=A 测-A 空。仅组织样本需要设置对照孔，对于组织样本，ΔA 测=A 测-A 对。
立即检测 405 nm处吸光值，计算ΔA 标 =A 标-AStd.6，AStd.6为不含 pNA的标准孔的吸光值。
注意：1.空白孔和标准孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验；2.对于组织样本，样本本身有颜色，需要设置对照孔，细胞样本一般不需要设置对照孔；3.在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；4.发现颜色变化比较明显时即可测定 405 nm的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间至 4 h。
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 按标准曲线计算
以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标为 y轴，绘制标准曲线 y=kx+b。将样本的ΔA 测带入方程得到 x值（μM）。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-8活性增加百分比=(实验处理组 A 测定-A 空白)/(实验对照组 A 测定-A 空白)×100%
该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
参考 Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在 37℃一个小时内可以剪切 1 nmol pNA底物产生 1 nmol游离 pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的 Caspase酶活性。
V 反总：反应体系总体积，0.105 mL=1.05×10-4L；V 样：加入的样本体积，0.05 mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；103：单位换算系数，1 μmol =103 nmol。
注意：对于样品中 Caspase-8酶活力特别高的情况，须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数 n。
A: 推荐使用KTA3025试剂盒，运用比色法对样本中caspase-8进行检测，灵敏高效。
杂志名称: Marine Environmental Research | 作者: Song, Hongce, et al.
IF: 3 | 发表时间: 2024
杂志名称: Journal of Thermal Biology | 作者: Aengwanich, Worapol, and Jaroon Wandee.
IF: 3 | 发表时间: 2024
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