糜蛋白酶活性检测试剂盒实验解决方案

原理糜蛋白酶，又称胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似，但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化，对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤手术后伤口愈合，如白内障摘除。糜蛋白酶催化ATEE水解，产物在237 nm有特征光吸收；通过测定237 nm光吸收增加速率，来计算糜蛋白酶活性。
自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测237 nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、恒温箱、制冰机、离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Reagent II：临用前配制；48 T加入12 mL去离子水，96 T加入24 mL去离子水充分溶解；用不完的试剂4℃避光可以保存3天。样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Reagent I，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。2.血清（浆）等液体样本：直接检测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到237 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。2.Reagent II置于37℃孵育30 min。3.操作表（下述操作微量石英比色皿或96孔UV板中进行）：

试剂	测定孔（μL）	空白孔（μL）
样本上清	20	0
Reagent I	0	20
Reagent II	200	200

充分混匀，于237 nm测定4 min内吸光值变化，分别记为A测定、A空白（从吸光值稳定增加开始计时），计算ΔA测定=A测定-A空白。注意：空白孔只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA测定小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测定大于1.0，样本可用Reagent I进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。糜蛋白酶活性的计算：（1）按蛋白浓度计算活性单位定义：25℃每mg蛋白每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。糜蛋白酶 (U/mg prot)=ΔA测定×V反总÷(Cpr×V样)÷T=2.75×ΔA测定÷Cpr（2）按样本质量计算活性单位定义：25℃每g组织每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。糜蛋白酶 (U/g 鲜重)=ΔA测定×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=2.75×ΔA测定÷W（3）按样本体积计算活性单位定义：25℃每mL血清每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。糜蛋白酶 (U/mL)=ΔA测定×V反总÷V样÷T=2.75×ΔA测定V反总：反应总体积，0.22 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入Reagent I总体积，1 mL；T：反应时间，4 min；W：样品质量，g。