乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性检测试剂盒实验解决方案

原理乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA Carboxylase，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。CheKine™ 乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织，细菌和细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测660 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent II：临用前配制；48 T加入5 mL ReagentⅠ，96 T加入10 mL ReagentⅠ，充分溶解，4℃避光保存可稳定1个月。Reagent III：临用前配制；48 T加入4 mL去离子水，96 T加入8 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。Reagent IV：临用前配制；48 T加入5 mL去离子水，96 T加入10 mL去离子水，充分溶解，4℃避光保存可稳定1周。Reagent V：临用前配制；48 T加入5 mL去离子水，96 T加入10 mL去离子水，充分溶解，4℃避光保存可稳定1周。Reagent VI：即用型；室温保存。注意：Extraction Buffer有毒且有刺激性气味，Reagent VI具有腐蚀性，建议在通风橱进行实验。Working Reagent：按去离子水：Reagent IV：Reagent V：Reagent VI=2：1：1：1的比例配制，现用现配。Standard：即用型；10 μmol/mL标准磷贮备液，使用前，平衡到室温。4℃保存。0.5 μmol/mL Standard：取50 μL Standard加950 μL去离子水，充分混匀。注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2.细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞30次（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s），然后8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3.血清（浆）等液体样本：直接检测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到660 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.将ReagentⅠ、II、III在37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）预热10 min。3.操作表（下述操作在1.5 mL离心管中操作）：

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）	对照孔（μL）
样本	0	0	10	10
ReagentⅠ	0	0	0	90
Reagent II	0	0	50	0
Reagent III	0	0	40	0
37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）准确反应30 min后，90℃灭活5 min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10,000 g，25℃离心5 min，取上清。以下操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作：
上清液	0	0	20	20
0.5 μmol/mL Standard	0	20	0	0
去离子水	20	0	0	0
Working Reagent	180	180	180	180

4.充分混匀，37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）孵育30 min后，冷却至室温，记录660 nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。注意：空白管和标准管只需做1-2次，每个测定管需要设一个对照管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.04可适当加大样本量。如果ΔA测定大于1.5，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。ACC活性的计算(1)按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每毫克蛋白每小时产生1 μmol无机磷的量定义为一个酶活力单位。ACC(U/mg prot)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(V样×Cpr)÷T=10×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr(2)按样本鲜重计算：酶活单位定义：每克样本每小时产生1 μmol无机磷的量定义为一个酶活力单位。ACC(U/g 鲜重)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=10×ΔA测定÷ΔA标准÷W(3)按照细菌或细胞数量计算酶活单位定义：每104个细菌或细胞每小时产生1 μmol无机磷的量定义为一个酶活力单位。ACC(U/104)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(n×V样÷V样总)÷T=10×ΔA测定÷ΔA标准÷n(4)按样本体积计算：酶活单位定义：每毫升液体每小时产生1 μmol无机磷的量为一个酶活力单位。ACC(U/mL)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(V样÷V样总)÷T=10×ΔA测定÷ΔA标准C标准：标准溶液的浓度，0.5 μmol/mL；V反总：反应体系总体积，0.1 mL；V样：加入的样本体积，0.01 mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30 min=0.5 h；n：细菌或细胞数量，以万计；W：样本质量，g。
注意事项1.配制Working Reagent最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。2.配好的Working Reagent应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染。3.显色结束后应立即检测，最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。