游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒实验解决方案
游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测550 nm处的吸光度）·恒温箱、制冰机、低温离心机·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·匀浆器（如果是组织样本）·玻璃瓶（用于配制提取液）·正庚烷、无水甲醇、氯仿（三氯甲烷）
试剂准备Extraction Buffer（自备）：取一个玻璃瓶，按照氯仿:正庚烷:无水甲醇=28:21:1的比例配制，盖紧后混匀，4℃避光保存。Cu Reagent：即用型；使用前，平衡到室温；混匀后使用，4℃避光保存。Chromogen：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。Standard：临用前配制，加1 mL Extraction Buffer，充分溶解得到64 mM Standard，未用完的已溶解的Standard可装于玻璃瓶中盖紧密封，4℃避光保存1个月。标准曲线设置：把64 mM标准品按下表所示，用Extraction Buffer进行下一步稀释。
序号 | 标准品体积 | Extraction Buffer体积（µL） | 标准品浓度（mM） |
Std.1 | 20 µL of 64 mM | 620 | 2 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (2 mM) | 100 | 1 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (1 mM) | 100 | 0.5 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (0.5 mM) | 100 | 0.25 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.25 mM) | 100 | 0.125 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.125 mM) | 100 | 0.0625 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.0625 mM) | 100 | 0.0313 |
注意：每次实验，请使用新稀释的标准品。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。1.动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 rpm，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2.植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），8,000 rpm，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3.细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），8,000 rpm，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。4.血清（浆）等液体：直接测定。
实验步骤1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到550 nm，可见分光光度计用去离子水调零。2.样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂 | 空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） |
Extraction Buffer | 240 | 200 | 200 |
不同浓度Std. | 0 | 40 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 40 |
混匀后盖紧瓶盖，置于涡旋混合器上中速涡旋30 s | |||
Cu Reagent | 80 | 80 | 80 |
混匀后盖紧瓶盖，置于涡旋混合器上中速涡旋30 s，室温（25℃）放置20 min；2,000 g，室温（25℃）离心5 min | |||
上层溶液 | 50 | 50 | 50 |
Chromogen | 200 | 200 | 200 |
3.室温（25℃）放置5 min。每管取出200 μL加入96孔板或微量玻璃比色皿对应的孔中，于550 nm测定吸光值，计算ΔA测=A测-A空、ΔA标=A标-A空（空白管只需做1管）。显色后务必在30 min内测完。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果A测定大于酶标仪检测范围，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入标准曲线公式计算出y (mM)。2.样本FFA含量计算(1) 按样本质量计算FFA含量(μmol/g质量)=y×V提取÷W×n=y÷W×n(2) 按细菌或细胞数量计算FFA含量(μmol/104)=y÷(细胞或细菌数量÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n(3) 按液体体积计算FFA含量(μmol/L)=1,000×y×nV提取：加入提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；n：样本进一步稀释的稀释倍数；500：细菌或细胞总数，500万个；1,000：单位换算系数，1 L=1,000 mL。
结果展示典型标准曲线
Figure 1. 96孔板分析的游离脂肪酸(FFA)标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线实验实例：
Figure 2. 试剂盒测定小鼠肝、绿萝中游离脂肪酸(FFA)的含量相关产品
Catalog No. | Product Name |
KTB2200 | CheKine™ 甘油三酯（TG）检测试剂盒（微量法） |
KTB2210 | CheKine™ 游离胆固醇（FC）检测试剂盒（微量法） |
KTB2220 | CheKine™ 总胆固醇（TC）检测试剂盒（微量法） |
