线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性检测试剂盒实验解决方案
线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）·恒温箱、制冰机、低温离心机·96孔UV板或微量石英比色皿·可调节式移液枪及枪头·去离子水·匀浆器或研钵
试剂准备ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。Working ReagentⅥ：临用前配制，48 T加入1 mL去离子水充分溶解，96 T加入2 mL去离子水充分溶解，未用完的已溶解的ReagentⅥ请分装后-20℃避光保存1个月，避免反复冻融。工作液的配制：临用前配制，将Reagent Ⅳ和ReagentⅤ以99:1充分混匀，根据用量，现用现配。如果检测样本是哺乳动物来源，请置于37℃孵育5 min；如果样本是其他物种，则置于25℃，孵育5 min。注意：Reagent Ⅳ有毒性，Reagent Ⅴ有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。线粒体呼吸链复合体Ⅰ的提取：1. 准确称取0.1 g组织或收集500万个细胞，加入1 mL ReagentⅠ和10 µL Reagent Ⅲ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆；2. 离心匀浆液，600 g，4℃离心5 min，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；3. 再次离心上清，11,000 g，4℃离心10 min，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅰ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；5. 在沉淀中加入200 µL ReagentⅡ和2 µL ReagentⅢ，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅰ酶活性检测。
实验步骤1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。2. 在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10 µL样本、200 µL工作液和15 µL Working ReagentⅥ，充分混匀后，立即读取340 nm处0 min 初始吸光值A1和2 min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。注意：（1）为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5）或ΔA大于 0.4，可用ReagentⅡ稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值，若ΔA出现负值，则说明样本中不含复合体Ⅰ或已降解。（2）线粒体呼吸链试剂盒是酶动力学原理的试剂盒，反应比较快，且反应趋于平衡之后，该可逆反应可能会出现负反应，建议如下：1. 样本组数：2-3个左右，该酶促反应速度快，且为酶促反应，需要把握好起始时间点和反应后的时间点；2. 仪器提前预热，且加样可安排在酶标仪旁边进行，加样混匀后直接放入；3. 如果ΔA偏小，可增加样本量（组织克重或者细胞数量），或者减少提取液用量；4. 样本尽量新鲜提取，如果不能马上使用，则把完整细胞或者分装的组织保存在-80℃，一个月内使用；5. 工作液临用前配制。6. 该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1860、KTB1870、KTB1880、KTB1890的测定。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。A. 使用96孔UV板测定的计算公式1. 按样本鲜重计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。上清中线粒体呼吸链复合体Ⅰ活力的计算上清的复合体Ⅰ活力(U/g 鲜重)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=3,654×ΔA上清÷W沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅰ活力的计算线粒体沉淀的复合体Ⅰ活力(U/g 鲜重)=[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V重悬×V样)÷T=731×ΔA沉淀÷W样本中复合体Ⅰ总活力的计算复合体Ⅰ总活力即为上清中复合体 I 活力与沉淀中复合体 I 活力之和。复合体Ⅰ总活力(U/g 鲜重)=3,654×ΔA上清÷W+731×ΔA沉淀÷W2. 按细胞密度计算单位的定义：每1万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。复合体Ⅰ活力(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V重悬×500)÷T=1.46×ΔAV反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；109：单位换算系数，1mol=109 nmol；V样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，2 min；ΔA上清：上清测定值；W：样本重量，g；V提取：提取体系体积，1.01 mL；ΔA沉淀：沉淀测定值； V重悬：重悬沉淀体积，0.202 mL；500：细胞总数, 500万。B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中的光径d:0.5 cm调整为d:1 cm进行计算即可。
结果展示实验实例： 1. 取0.1 g包菜进行样本处理，按照测定步骤操作，用96孔UV板测得：ΔA上清=A1-A2=0.7819-0.7804=0.0015，ΔA沉淀=A1-A2=0.783-0.7704=0.01262. 按样本质量计算得：上清中线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性(U/g 鲜重)=3,654×ΔA上清÷W=3,654×0.0015÷0.1=54.81 U/g沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性(U/g 鲜重)=731×ΔA沉淀÷W=731×0.0126÷0.1=92.106 U/g则线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性(U/g 鲜重)=3,654×ΔA上清÷W+731×ΔA沉淀÷W=54.81+92.106=146.916 U/g
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