谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒实验解决方案
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）·恒温箱·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·低温离心机·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Working Substrate：临用前配制，Substrate加入20 mL Assay Buffer，充分溶解；未用完的试剂分装避光于-20℃保存1个月。GR：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。Working H2O2：临用前配制，吸取21.5 μL H2O2加入5 mL去离子水，充分混匀，配制好的试剂当天使用；4℃避光保存。Working Reagent：临用前配制，根据样本数量，按照2 mL Working Substrate加入1 μL GR的比例配制，再加6 mL的Assay Buffer混匀（当天用完）；Working Regent在25℃（其他物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30 min以上。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。1. 组织样本：用冷的PBS清洗组织，尽可能去除血液。吸干组织上的水分，称重。称取0.1 g组织样本，加入1 mL预冷的Assay Buffer，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2. 血清（浆）：直接测定（如需要可用生理盐水稀释不同倍数）。3. 细胞、细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL预冷的Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。注意：样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；细胞中GSH-Px活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GSH-Px的提取时可加Assay Buffer后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。2. Working Regent于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育30 min。3. 在96孔UV板或微量石英比色皿中按照如下方式加样：
试剂 | 空白孔（μL） | 测定孔（μL） |
去离子水 | 20 | 0 |
Sample | 0 | 20 |
Working Reagent | 160 | 160 |
Working H2O2 | 20 | 20 |
4. 充分混匀，空白孔在340 nm处第10 s和第10 min 10 s的吸光值，分别记为 A1，A2，测定孔在340 nm处第10 s和第10 min 10 s的吸光值，分别记为 A3，A4，计算ΔA空=A1 -A2，ΔA测=A3-A4。注意：空白孔只需做1-2个即可。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用Assay Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。A.使用96孔UV板测定的计算公式如下：1. 按蛋白浓度计算GSH-Px 活力单位定义：在25℃或37℃温度下，每毫克蛋白每分钟催化1 nmol NADPH 氧化。GSH-Px (U/mg prot)=[ (ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)÷Cpr2. 按样本鲜重计算GSH-Px 活力单位定义：在25℃或37℃温度下，每克样品每分钟催化1 nmol NADPH氧化。GSH-Px (U/g 鲜重)=[(ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)÷W3. 按细胞或细菌数量计算GSH-Px 活力单位定义：在25℃或37℃温度下，每104个细胞或细菌每分钟催化1 nmol NADPH氧化。GSH-Px(U/104)=[(ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)÷5004. 按液体体积计算活性单位定义：在25℃或37℃温度下，每毫升液体每分钟催化1 nmol NADPH氧化。GSH-Px(U/mL)=[(ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)ΔA空=A1 -A2，ΔA测=A3-A4；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200 μL=2×10-4 L；109：1 mol=1×109 nmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W：样品质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20 μL =2×10-2 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；500：细胞或细菌数量，500万。B.使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中的光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。
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