细胞周期染色分析试剂盒实验操作步骤

原理

确定细胞周期阶段（G1，S和/或G2/M）的最常见方法是基于细胞DNA含量的测量。随着细胞进入细胞周期，G1期细胞具有一组成对的染色体，并且在DNA含量方面是一致的。另一方面，DNA的数量在S期开始增加一倍，因此DNA的数量是G1数量的一到两倍。与G1中的细胞和两组成对的染色体相比，G2/M期的细胞具有两倍的DNA量。

Abbkine细胞周期染色试剂盒基于核（DNA）染料（PI），当其与细胞中DNA的结合时，产生红色荧光信号（Ex/Em=535/615 nm），荧光强度与细胞DNA含量成比例，为分析处于细胞周期各相中细胞百分比提供了一种方便和准确的分析方案。  

自备耗材

·可调节式移液枪及枪头

·离心机

·流式细胞仪

·去离子水、PBS、70%乙醇

试剂准备

PI (50×): 平衡至室温，分装保存于-20℃，避光并避免反复冻融；

1×Assay Buffer: 通过用去离子水稀释10×Assay Buffer来制备1×Assay Buffer。使用前在冰上预冷1×Assay Buffer；

Staining Solution: 将100 µL RNase A溶液和200 µL PI (50×)加入10 mL 1×Assay Buffer中，充分混合并避光，4℃下可保存一周。

实验步骤

注意：PI的最佳浓度和孵育时间取决于具体应用。染色条件可能需要根据特定的细胞类型进行修改。

1. 用所需方法处理细胞；

2. 对于非贴壁细胞，通过离心（4℃，600 g，5 min）收集1-2×10⁶个细胞。对于贴壁细胞，首先使用胰蛋白酶消化细胞，然后离心；

3. 用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次；

4. 将细胞600 g离心5 min，除去上清，然后将细胞管转移至冰上；

5. 用预冷的70%乙醇缓慢重悬细胞，将细胞在-20℃下放置2 h或更长时间（建议过夜固定12-24 h）；进行染色和分析之前，这些细胞可以在-20℃下保存数周；

注意：将细胞固定在单个细胞悬液中非常重要。在固定过程中，细胞可能会聚集。缓慢滴加初始体积的70%乙醇，同时轻轻涡旋有助于防止细胞聚集；

6. 4℃，1,000 g离心5 min；

7. 除去乙醇，并将细胞重悬于1 mL冰冷的PBS中；

8. 4℃，500 g离心细胞10 min，然后除去PBS。重复步骤7和8两次以彻底除去乙醇；

9. 将细胞重悬于0.5 mL Staining Solution中，并在黑暗中于37℃孵育30 min；

10.用PBS洗涤细胞两次，并用预冷的PBS重悬。使用合适的PE通道（Ex/Em=535/615 nm），通过流式细胞仪在24 h内分析细胞。

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